番茄细菌性青枯病的防治研究

番茄细菌性青枯病的防治研究

0筛选和筛选生防菌剂植物细胞象（ralticformer）是一种毁灭性的土传性疾病。广泛分布于热带、亚热带和温带地区，在中国南方省、自治区、直辖市均有严重发生。生物防治一直是解决土传病害研究重点。以往研究多利用无致病力青枯菌或从土壤、植物根际筛选生防菌防治该病,均存在防效不稳定的问题。龙良鲲等和黎起秦等从番茄根内分离出青枯病的内生拮抗菌,也有一定的防效;但其在自然土壤中缺乏竞争力,用于大田防治青枯菌有一定的困难。作为外源微生物的生防菌在新的微生态环境中难以快速繁殖,在生态位的竞争中不敌土著微生物,故难以有效的定殖,发挥不出其应有的拮抗作用。为此,本文从微生态系统考虑,筛选构建由能拮抗青枯病病原菌的拮抗菌和与之协同、在土壤中可快速繁殖的营养菌组成的复合菌剂。该复合菌剂进入土壤后,可快速定殖,抑制青枯病的繁殖。目前少有用这样的复合菌剂作为对土传病害开展生物防治的报道。1材料和方法1.1土壤中kno3的土壤制备初筛培养基:牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基和马铃薯培养基(PDA)。复筛培养基:Ca(NO3)20.1g,K2HPO40.4g,KNO30.1g,MgSO4·7H2O0.3g,FeCl30.01g,土壤浸出液200mL(取肥沃菜园土200g,加水200mL,煮沸1h,随时补充失去水分,过滤,滤液补足200mL),水800mL。1.2肥的理化性质和有机质番茄品种为红宝石,是青枯病易感品种;病土是华南农业大学园艺学院番茄青枯病试验地的连作菜园土,有机质为32.09g·kg-1,全氮为1.594g·kg-1,pH=5.47,碱解氮为87.7mg·kg-1,速效磷为87.2mg·kg-1,速效钾为355.7mg·kg-1;有机肥为番禺青绿公司生产的固体肥,有机质为369.9g·kg-1,全氮为21g·kg-1,全磷为5.9g·kg-1,全钾为5.1g·kg-1;化学肥料用化学纯尿素、氯化钾和磷酸二氢钾。1.3soli1方法青枯假单胞杆菌(Pseudomonassolanacearum)由华南农业大学资源环境学院植物病理研究室提供;番茄青枯病病株由华南农业大学园艺学院提供。1.4选择和构建复合抗菌剂1菌落形态的获得营养菌系的筛选原则是培养条件粗放,且能在土壤中快速繁殖,与拮抗菌系协同生长。从菜园土、鸡粪堆肥和城市园林垃圾等中取样,采用稀释分离法。取稀释度10-5、10-6和10-7各0.1mL在初筛培养基上涂平板,于40℃培养48～72h,挑取不同形态的单菌落,进行纯化。再将初筛得到的细菌、酵母制成密度为108cfu·mL-1的菌悬液,霉菌和放线菌制成109cfu·mL-1的孢子悬液,按3%的接种量分别接种于装有140mL土壤浸出液培养基的250mL锥形瓶,于140r·min-1,40℃培养48～72h,选出长势旺盛的菌株。2培养基的制备从华南农业大学园艺学院番茄青枯病试验地的连作菜园土中取根围和根际土壤,采用稀释分离法。取稀释度10-5、10-6和10-7各0.1mL在初筛培养基上涂平板,于30℃培养48～72h,挑取不同形态的单菌落进行纯化,土壤浸出液复筛后进行抑菌试验。抑菌试验采用平板测定法。将复筛得到的营养菌和拮抗菌在对应的平板培养基上涂布,30℃条件下培养48～72h,使其长满整个平板,用打孔器制成直径为6mm的琼脂圆块。将普通细菌培养基熔化后冷却到45℃左右,然后加入番茄青枯病菌作指示菌,摇匀后迅速倒入培养皿制成平板。待凝固后,每个平板等距离放入以上琼脂圆块,于4℃静置12h,让琼脂里的次生代谢物质充分扩散到下层培养基。置30℃培养箱培养48h,观察抑菌圈,选出抑菌圈直径大的菌株。3复合菌剂的制备用以上平板测定法测定复选的营养菌系和拮抗菌系各菌种间两两拮抗作用,选出相互间无拮抗或拮抗作用较小的营养菌系和拮抗菌系,将细菌、酵母制成密度为108cfu·mL-1的菌悬液,霉菌和放线菌制成109cfu·mL-1的孢子悬液,按3%的总接种量接种于装有140mL土壤浸出液培养基的250mL锥形瓶,于140r·min-1,35℃混合发酵72h,得到复合菌剂。发酵后其总含菌量不少于6.5×109cfu·mL-1。1.5复合菌剂的制备方法按1.4的混合发酵工艺,用分光光度法(550nm)测定不同培养温度(25℃、30℃、35℃、40℃和50℃)对复合菌剂生长的影响。用0.1%的HCl溶液和0.1%的NaOH溶液将土壤浸出液培养基的pH值分别调为3、4、5、6、7、8和9,用分光光度法(550nm)测定各pH值下复合菌剂生长。1.6文献培养基的制备依据赵斌等的方法,将番茄青枯病菌制成109cfu·mL-1菌悬液,吸取1mL于培养皿,倒入20mL的营养培养基,摇匀。称取1g病土和研碎的番茄青枯病病株的茎组织,加入装有100mL灭菌的生理盐水的250mL三角瓶中,充分浸提后,稀释至105～106倍,吸取各提取液1mL于培养皿。每种提取液分别倒入20mL的营养培养基和PDA培养基,摇匀。待培养基凝固后,每个平板等距离放入2个牛津杯,使其紧贴培养基表面。各牛津杯均吸入0.2mL复合菌剂。平板置4℃,12h,让菌剂里的物质充分扩散到下层培养基。置30℃培养箱培养48h,记录抑菌圈直径。1.7不同施肥量的确定试验设3个处理:1)CK。不作任何接种处理;2)T1。接入浓度为6.5×108cfu·mL-1的复合菌剂30mL·kg-1土;3)T2。接入浓度为5×108cfu·mL-1青枯病病菌液20mL·kg-1土,复合菌剂30mL·kg-1土。每处理设4个重复。每盆4kg土壤。将化学肥料(占总施肥量的60%)及青绿固体有机肥(占总施肥量的20%)作为基肥,与土壤混匀,再按以上处理将病菌液和复合菌剂一并混匀,倒入瓦盆。每天喷水保持土壤湿度在30%～50%之间,让菌种活化1周后移栽已长4叶的番茄苗,每盆2株,共8株番茄。2004年7月12日育苗,7月31日移栽,9月21日收获。移栽15d、34d后追肥两次。每次追施10%化肥,使所有处理氮、磷、钾的施入量相等,即N,120mg·kg-1土;P,80mg·kg-1土;K,100mg·kg-1土。不足部分由无机肥补足。番茄生长期间观察并记录发病情况。2结果与分析2.1复合菌系对番茄青枯病菌生长和抗性的影响营养菌系初选出21株细菌、8株霉菌、7株酵母和3株放线菌。土壤浸出液培养复选出7株细菌、2株霉菌和3株酵母。拮抗菌系初选出10株细菌、2株霉菌和2株放线菌,复选出2株细菌和1株放线菌。再经菌间拮抗测定,最后筛选出4株细菌、1株霉菌、2株酵母和1株放线菌。经鉴定,分别为地衣形芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(Y1)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)(Y2)、产黄纤维单胞菌(Cellulomonasflavigena)(Y3)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)(J1)、绿色木霉(Trichodermaviride)(Y4)、产朊假丝酵母(Candidautilis)(Y5)、酿酒酵母(Saccharomycesrevisiae)(Y6)和细黄链霉菌(Streptomycesmicroflavus)(J2)。复合菌系在土壤浸出液培养基中的生长情况和对番茄青枯病菌抑菌试验的结果见表1,菌间拮抗结果见表2。复筛过程中被淘汰的菌株数据略。由表1可知,营养菌系中的Y1、Y3和拮抗菌系中的J1、J2对番茄青枯病病原菌有较强的拮抗作用,且在土壤浸出液培养基中生长旺盛;其他菌种则对病原菌无拮抗作用,也能在土壤浸出液中较快生长。表2显示,营养菌系中的Y1对Y2、Y3和J1有不同程度的拮抗作用,但较其对病源菌的拮抗作用小;Y2对J1也有轻微的拮抗。拮抗菌系中J1对Y2和Y5也有一定的拮抗作用;J2则对所有菌种都有不同程度的拮抗作用,尤其对病原菌强烈拮抗作用,宜让其单独发酵,然后与其他菌种的混合发酵液一起使用。2.2复合菌剂ph值对od650mn值的影响图1显示,在25～40℃范围内较为适合复合菌剂生长,其中35℃时的OD550nm值最高,40℃时的OD550nm值略低。这说明复合菌剂耐高温性较好。复合菌剂在pH值为6.0～8.0范围内生长较好(见图2)。在pH=7.0时,OD550nm值最高;在pH=6.0时,OD550nm值也较高。可见复合菌剂较适合在微酸性环境下生长。酸碱度适应范围为pH=6.0～8.0,最适pH值6.6,微酸性土壤发病重;青枯病病原菌生长发育温度为10～37℃。土温在20℃以上,病菌开始活动,25℃时活动最盛。复合菌剂生长条件与病原菌的基本一致,且生长条件粗放,并含有对病原菌有较强拮抗作用的菌种,可以预见生防效果较好。2.3复合菌剂抑菌效果复合菌剂的抑菌效果见表3。复合菌剂在营养和PDA平板上对番茄青枯病菌,在营养和PDA平板上对病土中的病原菌,在营养和PDA平板上对番茄青枯病病株提取液的抑菌圈直径分别为2.28cm、2.12cm,2.88cm、2.20cm,1.18cm和0.98cm。这说明复合菌剂对番茄青枯病菌、致病源中的微生物及侵入到番茄青枯病株中的微生物均有拮抗作用。复合菌剂较单一拮抗菌好(表1中,其最大抑菌圈直径为1.79cm),且对于侵入到番茄青枯病病株的具有较高活性和致病性的微生物也表现出较好的抑制作用。黎起秦等分离出来的5株拮抗真菌对番茄青枯病菌抑菌直径在0.91～1.41cm之间,本试验的复合菌剂抑菌作用较单一真菌的效果好。因此,有必要进一步研究盆栽条件下对番茄青枯病的防病效果。2.4复合菌剂对番茄青枯病的影响各处理的番茄青枯病发病情况见图3。由图3可知,CK最早发病,在移栽后21d已经发现发病;在移栽55d时发现5株病株,发病情况最为严重。这说明连作土确实潜伏着大量青枯菌。施入复合菌剂的处理能延缓番茄青枯病8～19d发病,且病株数减少2～3株,能较明显地减轻发病情况。其中T1能最大限度延缓发病时间,且防病效果明显;而T2处理由于接入了青枯病病菌液,发病株数较T1略有提高。这表明,防病效果是病菌和抑病的复合菌剂共同作用的结果,土壤病菌基数高低以及防病的复合菌剂的加入与否对防病效果有较大影响。3菌种组成及最佳比例的确定利用无致病力青枯菌菌株、拮抗细菌、菌根真菌等方法对青枯病进行生物防治,定殖能力是影响防效的一个重要因素。本文从微生态系统考虑,筛选并构建出的复合菌剂与传统的施单一拮抗菌或内生菌不同。该复合菌剂不但有直接拮抗病原菌的拮抗菌系,还包括与拮抗菌系有协同作用,在土壤中能快速繁殖,从营养和生态位竞争角度间接抑制病原菌的营养菌系。两者联合作用,可快速定殖,又可抑制病原菌,从而显现较好的生防效果。本文试验结果表明,复合菌剂有较好的协同关系,但J2则对所有菌种有不同程度的拮抗作用;因此单独发酵后再与其他菌种的混合发酵液一起使用。王伟东等筛选出1组未完全明确其微生物组成及结构的,具有比纯培养微生物更好的,功能、性质、组成稳定的木质纤维素分解菌复合系。菌系中的各菌株是不可分的,从中分离出来的稳定存在的5种菌种,再混合培养却不具分解能力。这样的复合菌系可能含有某些未知菌种和特定成分。本文构建复合菌剂的思路,是在了解有关菌种特性的基础上,根据用途把几种所用菌株进行恰当组合,使之优化,营养和拮抗性能比原有水平再提高一步,使复合菌系发挥协同、共生、加强等作用。这样构建的复合菌系种类是完全确定的,既拥有纯培养菌株营养要求单一,生理代谢稳定,易于调控等优点,又具有混合培养的功能,这为以后构建高效生防菌提供了一条重要的技术途径。复合菌剂中的菌种均从自然环境中筛选得来,对环境友好,且培养条件粗放,在25～40℃和pH=6.0～8.0能较好生长。在平板培养条件下对番茄青枯病病原菌、病土及番茄青枯病株中微生物均有明显拮抗作用;施入土壤后,能较快的定殖,抑制青枯病病菌的繁殖,延缓连作土发病时间并减轻发病情况;即使在土壤里加入青枯病病原菌,强化其致病作用后,仍能显示其防病效果。在研究番茄青枯病的施肥防治方面,蔡燕飞等通过施用有机肥从营养水平上调控土壤微生物的菌群结构。若根据青枯病发生规律,配合适当比例的有机肥和复合菌剂或制成微生物肥料后作为基肥,并在适当的时候追施菌剂,充分发挥“基质-菌群”效应,实行从营养竞争到微生物拮抗的全方位生态调控,可能会取得更好的抗病效果。本文初步研究