发酵工程制药-氨基酸、多肽及蛋白质类药物的发酵制药

生物制药工艺课程谷氨酸的发酵制药

发展前景

2008年，我国氨基酸的总产量已超过120万吨，其中谷氨酸占97%，我国谷氨酸钠的总产量已超过170万吨，比2005年增长了23.75%，全国谷氨酸及其盐销售总收入高达177.9亿元，行业实现利润12.6亿元，各公司的利润普遍上升。由于国内谷氨酸生产企业普遍重视质量管理，故出口谷氨酸及其盐的数量逐年递增，2006年，我国谷氨酸及其盐的出口量已突破10万吨大关从而成为我国医药业又一拳头产品。国内谷氨酸生产企业的谷氨酸产品已销往包括英、法、意大利、西班牙、比利时、瑞士和美国在内的世界57个国家，从而确立了全球第一谷氨酸生产大国地位。

生产流程

谷氨酸产生菌的扩大培养

为了生产大批量的谷氨酸，就需要更多的谷氨酸生产菌，因此就必须对谷氨酸生产菌进行扩大培养。我国主要使用菌株为北京棒状杆菌ASI1.299.

扩大培养普遍采用二级种子流程，即：

斜面菌种（33~34℃，培养18~24h

）→一级种子培养（1000mL三角瓶装入适量培养基200ml，灭菌后置于冲程7.6cm、频率96次／min的往复式摇床上振荡培养12h，培养温度33~34℃

）→二级种子培养（种子罐中培养，32~34℃

，7~8h，无杂菌）→发酵罐。活菌浓度达到108个/ml，活力旺盛，菌体健壮。

淀粉水解糖的制备

由于大部分产生菌不能直接利用淀粉和糊精，因此要将淀粉原料水解为葡萄糖，可采用双酶法，先用淀粉酶将原料分解为糊精和低聚糖，再用糖化酶进一步水解为葡萄糖。

谷氨酸的发酵机制及工艺控制

生产原料包括碳源、氮源、无机盐及管生长因子等。发酵原料的选择既要考虑生长繁殖的营养，还需要有利于谷氨酸的积累及易于提取。葡萄糖丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸天冬氨酸柠檬酸α-酮戊二酸谷氨酸反馈抑制优先合成

增强反馈抑制

逆转反馈抑制①②③CO2CO2乳酸磷酸烯醇丙酮酸

谷氨酸发酵条件控制1温度的控制生产菌最适生长温度为30~32`C，谷氨酸形成最适温度为34~37`C。2PH的控制前期控制在7.5左右，对抑制杂菌生长有利，中后期控制在7.2左右，这样谷氨酸脱氢酶活性最强，若后期PH过高，菌体自溶，谷氨酸变成谷氨酰胺。3菌龄及接种量控制一级种子菌龄11~12h，二级种子菌龄7~8h，接种量1%为好。

谷氨酸的提取等电点法是提取谷氨酸最简单的一种方法，此法操作简便，设备简单。1等电点法的原理PH<3.22谷氨酸以阳离子形式存在。PH=3.22其分子内部呈电中性，溶液中总静电荷为零，谷氨酸分子间相互撞，结合成较大聚合体沉淀，此时谷氨酸溶解度最小。PH>3.22谷氨酸以阴离子形式存在，影响到谷氨酸析出的主要因素为：谷氨酸的含量、T、加酸速度，搅拌、菌体大小及多少。2操作要点发酵液

排入电桶测T、PH测氨基酸含量搅拌冷却至30℃加盐调PH形成晶核静止4~6h放出上清液清除结晶深沉表层少量菌体取出氨基酸结晶离心分离常提高谷氨酸发酵产率的措施一、选育高产菌种

途径：可通过菌种自发突变过程中挑选出来，也可利用物理或化学诱变剂处理微生物细胞群，促使其突变，然后挑选出符合目的的育种诱变株，还可利用体外DNA重组、原生质体融合等技术创造出高产菌。

优势：谷氨酸脱氢酶活力强、氧化还原氨基化反应强、二氧化碳固定反应强、异柠檬酸脱氢酶活力强、不分解和利用谷氨酸、耐高糖，高浓度谷氨酸。二、根据菌种特征控制最适宜的发酵条件

如：生物素、磷、PH、氧传递速度、氧化还原电位及温度等。三、追加糖液法

即采用较低初糖浓度和大接种量以利于菌体迅速繁殖获得生产需要的足够强壮的菌体的一种方法。

噬菌体与杂菌的防治一、

谷氨酸发酵中噬菌体的污染与防治1.谷氨酸噬菌体的主要特征：具有非常专一的寄生性不耐热性PH的稳定性嗜氧性对干燥的稳定性不耐药性二、谷氨酸发酵污染噬菌体后的异常现象1.发酵液光密度在初期开始上升，而后又下降或不上升2.发酵液PH逐渐上升，4~8小时内可达8.0以上，且不下降3.不耗糖或耗糖缓慢4.泡沫大，粘度大，有时呈胶状，可拔丝5.发酵周期长，产酸低或不产酸三、防治噬菌体污染的主要措施1.严格控制活菌体的排放2.严防噬菌体进入种子罐或发酵罐3.发酵罐中污染噬菌体后的抢救轮换菌种法灭噬菌体法放罐重消毒谷氨酸发酵中杂菌的污染与防治1.检查杂菌的方法

显微镜检查法、培养皿划线检查法、肉汤培养检查法2.杂菌污染的防治（1）杂菌污染的主要原因分析种子带菌罐体与管件渗漏所引起的染菌死角及空气系统染菌（2）杂菌污染的防治与挽救一级种子经平板检查无菌后方可接到二级种子中二级种子冷却，10摄氏度以下保压12~16小时，平板检验无杂菌后，再接入发酵罐。发酵0~6小时后，大幅度染菌，镜检发现球菌，应放罐重消毒，消毒温度适当降低。发现染菌的罐，下次空罐消毒加入甲醛后，再用蒸汽熏蒸，甲醛的用量一般为0.12~0.17升/立方米。

由谷氨酸制成味精

谷氨酸的中和、脱色、和除铁中和液的除铁目前除铁、锌离子的方法主要由硫化钠和树脂法两种。硫化钠除铁是利用其离子状态下能与铁、锌生成沉淀物的原理除铁。树脂法除铁是利用弱酸性阳离子交换树脂，吸附铁或锌得以除去。谷氨酸的中和

在中和时，要控制投料比适当，即湿谷氨酸与水之比为1：2，湿谷氨酸与纯碱之比为1：0.3~0.4，中和温度60~65`C，控制PH为6.7~7.0。中和液的脱色物理方法：活性炭脱色化学方法：离子交换脱色法中和液的浓缩和结晶1.中和液的浓缩：通常由两种方法（1）降低溶液的温度使溶质的溶解度减小，达到过饱和状态。（2）在温度不变的情况下，蒸发掉溶液的一部分水，使溶液浓度升高，达到过饱和状态。2.谷氨酸纳的结晶析出基本过程：浓缩、起晶、整晶、育晶、放罐要求：杂质含量少，透光度在百分之九十以上3.干燥、包装和成品的质量标准生物制药工艺课程谷胱甘肽的发酵制药

谷胱甘肽（glutathione）是一种由3个氨基酸组成的短肽，存在于几乎身体的每一个细胞中，但是谷胱甘肽必须在有产生的细胞及其前体（Vc和α-硫辛酸）的条件下才可以有效地在人体内工作，谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，在细胞中，谷胱甘肽主要发挥抗氧化剂的作用。谷胱甘肽由谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸组成，分子中半胱氨酸的-SH是主要的功能性基团。谷胱甘肽广泛分布于自然界的生物体中(Wierzbicka等，1989)，主要存在于酵母、动物肝脏、肌肉、血液中，许多植物，如蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类及细菌中也含有一定量的谷胱甘肽。GSH的简介及结构谷胱甘肽的氧化与还原谷胱甘肽的理化性质

晶体呈无色透明细长粒状，溶于水、稀醇、液氨和二甲基甲酞胺，而不溶于醇、醚和丙酮。谷胱甘肽固体较为稳定，而水溶液在空气中则易被氧化，两分子还原型谷胱甘肽(GSH）的活泼巯基氧化缩合为二硫键，即得到氧化型谷胱甘肽（GSSG）。谷胱甘肽分子量为307．33，熔点189～193℃(分解)，晶体是无色透明细长柱状(板状)，等电点(PI)为5．93，成品见光易分解，易氧化。在氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽中，只有还原型谷胱甘肽才具有生理活性，而生物体内的氧化型谷胱甘肽需要还原后才能发挥其重要的生理功能。因此，我们在提取谷胱甘肽时，可以在溶液中加入具有强还原性的物质如维生素C等，当存在这些强还原性的物质时可以保护谷胱甘肽不容易被氧化。GSH的生理功能1.抗自由基,保护细胞2.解除外源性有毒物质(包括药物)的毒性3.促进细胞合成蛋白质4.参与转甲基、转丙氨基反应,维持肝细胞正常功能5.参与胆红素代谢6.促进胆酸代谢,减轻出血倾向7.是多种酶的辅基或辅酶GSH在疾病上的应用易与碘乙酸、芥子气（一种毒气）、铅、汞、砷等重金属盐络合，也能与某些药物（如扑热息痛）、毒素（如自由基、重金属）等结合，把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。GSH与溶血性疾病的治疗。保护红细胞膜上的巯基免遭氧化物的损害，保护红细胞膜的完整性，从而维持红细胞的正常的结构与功能。GSH与糖尿病的治疗。SH参与葡萄糖诱导的胰岛素分泌，血浆中GSH/GSSG的比率可影响细胞对葡萄糖的反应性，此比率的增加可改善糖尿病患者外周胰岛素的作用提高血液中GSH的水平，减少氧化损伤的程度和增加胰岛素的敏感性。还参与肝炎、角膜炎、白内障及视网膜疾病动脉粥样硬化病的治疗。

生产成本和研究进展目前，国内市场上还原型谷光甘肽的原料药价格在4000元/kg以上，而谷胱甘肽的生产成本约1500元/kg左右谷胱甘肽的生产方法主要有化学合成法、酶转化法和发酵法。目前，化学合成法和提取法已经工业化，酶转化法正在进行广泛研究，尚未用作GSH的工业化生产。微生物发酵法用于谷胱甘肽的生产是当前世界上主要的生产方法，国外谷胱甘肽的主要产地在日本，国内谷胱甘肽的研究起步较晚，现在主要还是在一些研究院校内，处于研究阶段，没有形成一定的生产规模。谷胱甘肽的生产工艺·萃取法萃取法经常用于从高含谷胱甘肽的动植物组织中提取谷胱甘肽的一种常用方法，也是生产谷胱甘肽的经典方法。·化学合成法基础原料均用的是谷胱甘肽化学式中的三种主要成分即谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸。·酶法利用生物体含有谷胱甘肽合成酶L一谷氨酸．L一半胱氨酸及甘氨酸为底物，并加少量三磷酸腺苷即合成谷胱甘肽。·发酵法谷胱甘肽在1888年，由deRey-Pailhade从酥母中分离出谷胱甘肽以后，谷胱甘肽从酵母中提取的工艺也越来越成熟，并且已经成为目前生产谷胱甘肽普遍采用的方法。酵母发酵法生产谷胱甘肽工艺流程图诱变剂→酵母→高产酵母→热水抽提→离心→调PH值→树脂吸附→酸洗脱→新鲜的CuO沉淀→离心沉淀物→H2S置换→离心过滤→浓缩→脱色→喷雾干燥→成品菌种的选育：酵母菌选育抗乙硫氨酸突变株：γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶是催化谷胱甘肽合成的主要酶。他受谷胱甘肽的反馈抑制，乙硫氨酸是谷胱甘肽的结构类似物，低浓度时促进谷胱甘肽的合成，高浓度时要抑制细菌生长和谷胱甘肽的合成。选育抗锌离子的突变株：zn是多种脱氢酶，脱羧酶和肽酶的辅因子，在低浓度时促进细菌生长，当达到一定浓度时能使谷胱甘肽还原酶活性中心变构失活，抑制胞内谷胱甘肽的继续合成。培养基：碳源：葡萄糖蔗糖糖蜜葡萄糖是最佳碳源。氮源：牛肉膏蛋白胨酵母膏牛肉膏是最佳氮源。单一氮源对细胞生长和谷胱甘肽的产量明显优于有机氮源，混合无机氮源对谷胱甘肽的产量有明显的提高。无机盐离子：微生物在缺乏Mg时，不能合成谷胱甘肽；Mg过量会抑制谷胱甘肽的合成。在10mmol/L时，产量达到最大。温度：较高的温度有利于细胞的生长，但是低温更有利于谷胱甘肽的合成。因此前期控制37培养菌体，后期降低温度增加谷胱甘肽的合成。PH：细胞生长最适PH和产物合成最适PH并不一致。一般细胞生长最适PH为7.2，产物合成最适PH为6.7。溶氧：通气量控制在5L/min时，搅拌转速达到300r/min即可满足细胞生长和谷胱甘肽合成对溶解氧的需求。前体物质：1）谷氨酸半胱氨酸甘氨酸混合物。开始时加入会对细胞生长和谷胱甘肽的合成油抑制作用，在发酵12小时以后（进入对数生长后期）添加会提高谷胱甘肽的产量。