不同基因对籼米淀粉rva谱特征的影响

不同基因对籼米淀粉rva谱特征的影响

低利益繁殖和各种优势的成功利用，显著提高了主要品种的产量潜力。然而,目前我国不少大面积应用的主栽水稻品种的品质偏低,改良稻米品质,特别是食用品质已成为水稻育种的重要内容。多年来,人们常用表观直链淀粉含量(AAC)、胶稠度(GC)、糊化温度(GT)3个理化指标,并以感官品尝为辅助来评价食用品质,取得了明显的成效。为了更加准确地鉴别稻米品质,近来不少学者提出辅以RVA谱特征值来帮助鉴定稻米的品质,并开展了相应的研究,表明这些指标无论对于确定稻米的加工品质或蒸煮品质都是有价值的。食用精米的主要成分是淀粉,因此淀粉品质与食用品质直接相关。稻米胚乳淀粉由直链淀粉和支链淀粉两部分组成,已知直链淀粉的合成主要由颗粒结合淀粉合成酶基因(简称Wx)控制。支链淀粉合成的遗传控制比较复杂,参与控制这类淀粉合成的基因包括分支酶基因(如Sbe1、Sbe3等)、脱分支酶基因(如Isa、Pul等)和可溶性淀粉合成酶基因(如SssI、SssII、SssIII等)。已有的研究表明,稻米胚乳直链淀粉含量直接与Wx基因的表达水平有关;其量过高会导致米饭干硬、缺乏黏性;过低又导致黏性太强,都不受消费者欢迎。Bao等的研究表明,稻米淀粉的黏性特征,以RVA谱代表的几个特征值中,多数受Wx基因控制。因此,Wx基因对稻米蒸煮与食用品质的优劣起着重要作用。但是,在Wx基因基本不表达的糯稻品种中(基因型为wxwx),RVA谱特征值也存在明显的品种间差异,说明影响稻米黏性特征的,除Wx外,还有其他基因。为了明确参与控制稻米淀粉合成的众多基因中哪些对稻米淀粉RVA谱特征可能产生影响及其影响程度,我们研究了Wx、Sbe1、Sbe3、Isa、Pul、SssI等淀粉合成相关基因。1材料和方法1.1稳定品系的制备以优质粳型糯稻苏御糯为母本,品质较差的籼稻桂朝2号,并用桂朝2号回交两代再自交三代得到的稳定品系(BC2F4)67个。2004年种植于扬州大学实验农场,每系30株。1.2黏度的测定主客观黏度法采用澳大利亚NewportScientific仪器公司生产的3-D型黏度速测仪及其配套软件TCW(ThermalCycleforWindows),按AACC(美国谷物化学家协会)操作规程(199561-02)进行测定。米粉过100目筛,含水量调至14%。将3.00g精米粉加入干净测验罐,加入25.00mL蒸馏水,混匀后将搅拌杆置罐中,先以960r/min的速度转动10s以分散米粉,然后以160r/min的速度恒速转动并进行黏滞性测定。测定过程12.5min,其间温度从50℃1.0min升至95℃,保持2.5min,再降至50℃,保持1.4min。黏度单位是RVU(rapidviscounits)。包括5个一级数据,即最高黏度(peakviscosity,PKV)、热浆黏度(hotpasteviscosity,HPV)、冷胶黏度(coolpasteviscosity,CPV)、峰值时间(peattime,PeT)和起始糊化温度(pastetemperature,PaT),以及3个二级数据,即崩解值(breakdownvalue,BDV)、消减值(setbackvalue,SBV)、回复值(consistencevalue,CSV)。1.3冀县县20s基因组间的序列和发展分子标记采用CTAB法提取水稻叶片基因组DNA。根据已发表的籼稻(9311)和粳稻(日本晴)基因组间的序列差异(http://rgp.dna.affrc.go.jp),发展分子标记。引物由上海生工合成,PCR程序按常规方法进行。1.4统计方法根据基因型检测结果进行基因型分组,用SPSS11.0软件对基因型间的差异进行方差分析,用PLSD法进行多重比较。2结果与分析2.1可溶性淀粉合成酶基因sssii等分子标记的构成为了对亲本品种苏御糯和桂朝2号及其BC2F4的67个品系2010个单株的淀粉合成相关基因的基因型进行鉴定,我们利用了本实验室已发展的部分分子标记,这些分子标记可以检测的基因包括分支酶基因Sbe1、Sbe3,异淀粉酶基因Isa、Pul。也引用了钱前等发展的SSR标记用以检测稻米糊化温度基因SssII-3(ALK)。此外,本研究又根据籼稻和粳稻基因组间的序列差异,发展了可溶性淀粉合成酶基因SssI等4个基因的分子标记。这4个标记在两个亲本间均具有多态性,所有这些被检测的基因及其引物序列见表1和图1。根据Sano等研究,颗粒结合淀粉合成酶基因Wx在普通籼粳稻之间存在明显的分化,在籼稻中为Wxa,在粳稻中为Wxb,它们与编码区第一内含子+1位碱基为G(籼稻)或T(粳稻)相关联,可用分子标记“PCR-AccⅠ”进行区分。本研究中桂朝2号在该基因座上的Wx基因已被证明为Wxa,苏御糯为隐性基因wx。可根据米粒透明与否进行判别,蜡质不透明且穗上不分离的为糯稻,基因型为wxwx,基因来自苏御糯;透明且穗上不分离的基因型为WxaWxa,基因来自桂朝2号。对67个系2010个单株共10个基因座,共检测到单基因代换系10种,它们都有一个淀粉合成相关基因被苏御糯的相应基因所置换,其余的都已回复到轮回亲本状态。这些单基因代换系中置换的基因均来自供体亲本苏御糯,为与桂朝2号的对应基因相区别,除Wx以外,来自苏御糯的基因均在基因符号右上角加注‘S’,另外,在表现为糯性的回交后代中,发现了4种代换系,其中除Wx以外,还有一个淀粉合成基因已被苏御糯置换。所有这些系的名称及其基因型列于表2。利用这些材料可进一步分析单个基因置换可能发生的遗传效应。2.2与轮回亲的wx基因座的比较由Wx基因编码的颗粒结合淀粉合成酶是合成直链淀粉的关键酶。由于直链淀粉含量的高低对稻米蒸煮和食用品质有很重要的影响,因而Wx一直是品质研究中最受关注的基因。该基因对稻米淀粉RVA谱的几个特征值都有重要的作用,这可从表3清楚地看出。品系01与品系11相比,就已检测的10个基因座而言,前者带有桂朝2号所有的淀粉合成基因,其中包括控制直链淀粉合成的主基因Wxa,即它的淀粉合成相关基因座的基因型已回复到与轮回亲本桂朝2号相同的状态;后者除带有来自苏御糯的隐性蜡质基因wx外,其余淀粉合成相关基因也都与桂朝2号相同,两者主要差异在于Wx基因的不同。因而,两者RVA谱的8个特征值均显示出明显的不同。品系11除最高黏度(PKV)外,清楚地表现为糯稻的RVA谱特征,也就是说,尽管品系11除Wx基因座外,其他淀粉合成相关基因座的基因型已回复到与轮回亲本桂朝2号相同的状态,但它的RVA谱各项特征值均未表现出桂朝2号的特征,说明Wx是影响RVA谱特征的最重要的基因,它对其他基因的作用表现有明显的上位性效应。在一定程度上,稻米淀粉的RVA谱的主要特征值,主要受Wx基因控制。2.3苏御糯米和品之间的关联除了Wx基因以外,稻米淀粉合成中其他基因对RVA谱有何作用是稻米品质改良中广泛关注的另一个问题。它们的作用可以从品系11与品系16(苏御糯)的差异进行分析(表3)。如上所述,品系11与苏御糯都是糯稻,而且品系11中的蜡质基因wx来自苏御糯,在蜡质基因座的基因型上,与苏御糯是完全相同的。所不同的是,苏御糯是粳型糯稻,除蜡质基因外,其他淀粉合成相关基因(主要是参与支链淀粉合成的基因)均与粳型品种相似;而品系11是以桂朝2号为轮回亲本育成的糯稻,除wx基因外,其他基因基本上已回复到桂朝2号状态,因而苏御糯(品系16)与品系11的RVA谱的差异反映了在糯性背景下,支链淀粉合成相关基因对稻米淀粉RVA谱特征的效应。它们虽然从总体上都表现糯稻的特征,各项RVA谱特征值都偏低,但它们的差异是很明显的。在最高黏度、热胶黏度、冷胶黏度、崩解值、回复值和峰值时间这6项指标上,品系11均极显著地高于苏御糯,特别是前3项指标均比苏御糯高出1倍甚至更多。这充分说明,除Wx以外,其他基因对稻米淀粉RVA谱特征也是有影响的。这些基因主要参与支链淀粉的合成,涉及分支酶、可溶性淀粉合成酶和脱分支酶等基因,其中究竟何种基因起作用,需要进一步分析。2.4最佳基因的确定在桂朝2号与苏御糯杂交,以桂朝2号回交2代后经3代自交获得的稳定品系中,9种非糯品系(品系02~品系10)经检测分别有一个淀粉合成基因被苏御糯的等位基因替代。另有4个糯性品系(品系12~品系15),除wx基因源于苏御糯的隐性蜡质基因外,也各有一个淀粉合成相关基因已被源于苏御糯的等位基因所替代。这些品系胚乳淀粉的RVA谱特征值分别列于表4和表5。在非糯品系中(Wx基因源于桂朝2号),桂朝2号的支链淀粉合成相关基因中如果仅有1个被苏御糯的等位基因置换,对胚乳淀粉的RVA谱特征大多不会有很大的影响。其中可能有影响的是苏御糯的异淀粉酶基因Isa置换桂朝2号的等位基因(品系09)以后,与品系01相比,崩解值降低,峰值时间增长;同样,苏御糯的可溶性淀粉合成酶基因SssⅠ(品系02)和SssⅢ-1(品系04)分别置换桂朝2号的等位基因后,与品系01相比,冷胶黏度和回复值均升高。在不同的单基因置换系之间,RVA谱也会出现一些差异,例如在品系02和品系06之间,前者置换了可溶性淀粉合成酶基因SssⅠ,后者置换了可溶性淀粉合成酶基因SssⅣ-1,两者在热胶黏度、冷胶黏度、消减值和回复值4个性状上也显示有一定的差异,类似的情况在其他品系间也存在,说明淀粉合成相关基因之间存在着互作。在糯性水稻品系中,单个基因置换的效应与非糯水稻中明显不同。其中以品系13表现最为明显。分子检测结果表明,该品系的SssII-3基因已被苏御糯的等位基因所置换,其他淀粉合成相关基因仍保持了桂朝2号状态(不包括Wx基因),但它与品系11相比,在RVA谱的PKV、HPV、CPV、BDV和PeT5个特征值上都表现出明显的不同。表现为桂朝2号的SssII-3基因被苏御糯的等位基因置换后,其RVA谱的5个特征值会在品系11的基础上进一步趋近苏御糯的性状特征。已知SssII-3是控制稻米糊化温度的基因,是除Wx外,对RVA谱起重要影响的另一个基因。在糯性水稻中,它的作用尤为明显。另外,它对起始糊化温度(PaT)并不表现明显效应,说明起始糊化温度(PaT)与稻米糊化温度(GT)并非同一性状。除品系13外,品系12、14和15的RVA谱与品系11比较,也有1~2个特征值表现有明显的差异,说明在糯性水稻中,单个基因置换的遗传效应远比非糯背景下要大,并且Wx基因对其他淀粉合成基因具有上位性效应,同时不同基因对RVA谱特征值的影响是不同的。3讨论3.1wx基因对稻米淀粉品质的影响稻米RVA谱是指稻米淀粉与一定量的水混合后,米浆在不同温度下的黏度变化曲线。它可以比较灵敏地反映不同品种间淀粉的品质差异。为此,在稻米品质研究中,对RVA谱各特征值的研究已受到广泛的重视。隋炯明等的研究表明,表观直链淀粉含量与RVA谱的几个主要特征值之间均存在相关关系。一般来说,随着表观直链淀粉含量的提高,稻米淀粉的最高黏度、热浆黏度、冷胶黏度、消减值和回复值等都会跟着提高。其中,最高黏度和热浆黏度提高会导致米饭的柔软度降低,而冷胶黏度提高更会导致米饭冷却过程中硬度增加;超过一定的限度便会出现“回生”现象。Bao等以窄叶青8号与京引17的DH群体进行QTL定位发现,RVA谱几种主要特征值的表现均与Wx基因有关,因而认为稻米的RVA谱主要受Wx基因控制。由于受研究材料的限制,他们未能调查其他淀粉合成基因对RVA谱的影响。本研究利用桂朝2号与苏御糯杂交和回交后代选得的遗传材料研究表明,颗粒结合淀粉合成酶基因Wx对稻米淀粉RVA谱主要特征值确实有重要影响,表现在该基因座的基因型为WxaWxa的情况下,与淀粉合成相关的其他基因座单一基因型的改变(被苏御糯的相应基因替换)一般不会显著改变RVA谱的主要特征,而当Wxa被源于苏御糯的隐性基因wx置换以后,淀粉合成其他基因发生改变后的效应便会明显地表现出来。以品系11为例,该品系的Wx基因已被苏御糯的糯性基因wx所替代,尽管该品系的其他淀粉合成基因均与桂朝2号相同,但RVA谱的主要特征值都已明显地趋近于苏御糯的特征。说明Wx基因相对于这些基因均表现为明显的上位作用。进一步分析Wx基因存在情况下其他基因座基因置换所产生的效应时,也可发现一些细微的差异。例如,当SssI基因座被苏御糯的相应基因置换以后(品系02),其冷胶黏度和回复值均偏高;类似的效应也可在SssIII-1基因被置换后看到(品系04)。相反,当基因Isa被苏御糯的等位基因置换后,崩解值有降低的表现,峰值时间则有所变长。需要指出的是,本试验中所观察到的遗传效应都是单个基因置换后的效应值。对两个或两个以上不同基因同时被置换后所产生的效应,由于受试验材料的限制,未能进行研究。而在育种实践中,杂种后代不同基因之间的组合是广泛发生的,这很可能是不同品种间淀粉品质差异的原因之一。既然Wx基因对稻米淀粉品质起着极为重要的作用,进一步研究Wx基因座可能存在的等位性变异,以及不同复等位基因对稻米淀粉品质的影响自然有着很重要的意义。目前对于Wx基因变异的研究已经获得了一些重要的结果。王宗阳等研究发现,Wx基因第一内含子+1碱基G/T变异,可影响转录后RNA的剪切效率,从而影响GBSS的合成数量,进而影响稻米胚乳直链淀粉的含量。Bligh等发现Wx基因启动子区存在的微卫星序列(CT)n重复数的多少与Wx基因的表达存在明显的相关关系。但是,