胰凝乳蛋白酶活性与稳定性的研究

胰凝乳蛋白酶活性与稳定性的研究

0酶的催化活性中酶机械反应是酶学的一个新领域。与传统的水相酶反应相比，它有许多独特的优势。酶在有机溶剂这种非常规条件下的催化行为,使人们可以利用生物催化剂独有的高选择性、温和的反应条件及高催化效率等优点来解决许多化学催化剂难以实现的复杂的有机合成反应。由于在有机溶剂中进行的酶催化反应通常所需时间较长,因此作者对于酶在有机溶剂中能否长时间保持其催化活性进行了详细的研究。α-胰凝乳蛋白酶(EC3.4.21.1)是一种丝氨酸肽链内切酶,主要切断以芳香氨基酸(如Trp,Phe,Tyr)的羧基形成的肽键。它在蛋白质研究工作中是一个重要的工具酶。选用α-胰凝乳蛋白酶为研究对象,测定了它在4种疏水性不同的有机溶剂中的活性变化。在绝对无水的有机溶剂中,酶不表现催化活性。在体系中加入一定量的水对保持酶的活性是至关重要的。而水溶液的pH值及缓冲液类型等因素对酶的稳定性和催化活性也有重要影响。因此,还研究了在水溶液中,不同pH值条件下α-胰凝乳蛋白酶的活性与稳定性,以及在不同pH值条件下离子强度及离子类型对酶活性与稳定性的影响。CD谱是研究溶液中蛋白质主链构象的常规技术,目前已广泛应用于酶蛋白的结构研究。通过测定α-胰凝乳蛋白酶在不同pH值缓冲液中的CD谱来研究酶蛋白的二级结构,进一步了解酶在溶液中的活性及稳定性与其结构的关系。1紫外分光光度法α-胰凝乳蛋白酶购自Sigma公司,比活力为9295ATEEU/mg蛋白。其他化学试剂均为国产分析纯,所用水为二次去离子水。紫外分光光度计为ShimadzuUV-265FW。圆二色谱仪为ISAJOBINYVON-SPEX。α-胰凝乳蛋白酶的比活力测定参照文献报道的测定其水解活性的通用方法。定义α-胰凝乳蛋白酶在时间t测得的比活力与初始比活力的比值即为α-胰凝乳蛋白酶在时间t的相对活力。2结果与讨论2.1酶的相对活力在25℃,疏水参数LogP值(LogP值定义为该溶剂在正辛醇-水体系中分配系数P的对数)不同的有机溶剂中,测定α-胰凝乳蛋白酶在24h内不同时间的相对活力,观察酶的活性与稳定性,实验结果列于表1。由表中数据可以看出,α-胰凝乳蛋白酶在疏水性差异较大并且涵盖范围比较广的4种有机溶剂中搅拌24h后都能够保持较高的催化活性(搅拌24h后,酶的相对活力均保持70%以上),说明酶在有机溶剂中具有较高的稳定性。这一结论为在有机溶剂中进行酶催化反应提供了科学依据。本科研组曾经在上述4种有机溶剂中用α-胰凝乳蛋白酶催化合成了一系列生物活性肽及其片段衍生物,并获得了满意的结果。2.2蛋白酶活力曲线在25℃,0.05mol·L-1,pH=5.0,7.0,10.0的3种缓冲溶液中分别测定α-胰凝乳蛋白酶在不同时间的相对活力,得到酶相对活力-时间曲线为图1。实验结果表明,α-胰凝乳蛋白酶在pH=10.0的缓冲液中的稳定性最高,在pH=5.0的缓冲液中其次,在pH=7.0的缓冲液中最低(α-胰凝乳蛋白酶在上述3种溶液中搅拌12h后的相对活力分别为92.9%,31.2%,9.7%)。2.3酶的稳定性测定Torchilin等发现在pH=8.0的条件下,α-胰凝乳蛋白酶在KCl溶液中的稳定性随着KCl摩尔浓度的增大而增高。本工作测定了pH=7.0时,α-胰凝乳蛋白酶在不同摩尔浓度的缓冲液(0.05mol·L-1,0.50mol·L-1)及加入不同无机盐(KCl,NaCl)的缓冲液中的相对活力随时间的变化(图2)。实验结果表明,α-胰凝乳蛋白酶在较高离子强度(离子强度I等于溶液中每种离子的质量摩尔浓度乘以该离子的价数的平方所得诸项之和的一半)缓冲液(b,c,d)中的稳定性明显高于在较低离子强度缓冲液(a)中的稳定性(酶在b,c,d3种溶液中搅拌24h后的相对活力保持在65%以上,而在a溶液中只有8.1%)。在pH=5.0的条件下得到相类似的实验结果(图3,酶在b溶液中搅拌24h后的相对活力为73.7%,而在a溶液中只有10.8%)。但是,在pH=10.0的条件下则得到相反结果,α-胰凝乳蛋白酶在较高离子强度缓冲液(b,c)中的稳定性低于在较低离子强度缓冲液(a)中的稳定性(图4,酶在a溶液中搅拌24h后的相对活力为87.9%,而在b,c2种溶液中还不到65%)。这说明离子强度在不同pH条件下对α-胰凝乳蛋白酶的稳定性的影响不同。在pH=5.0和pH=7.0的条件下,α-胰凝乳蛋白酶的稳定性随着离子强度的增大而提高,而在pH=10.0的条件下,α-胰凝乳蛋白酶的稳定性随着离子强度的增大而降低。2.4不同缓冲液对稳定性的影响在pH=7.0的缓冲液中(图2),α-胰凝乳蛋白酶在离子强度近似(I≈1),但是所含离子类型不同(K+,Na+,Cl-,HPO2−442-,H2PO-4)的b,c,d3种缓冲液中的稳定性相差不大,并且在pH=10.0的缓冲液中(b,c)也有类似结果(图4);由此可以判断离子的类型对α-胰凝乳蛋白酶稳定性的影响较小,即影响酶稳定性的因素主要是离子强度,而非离子类型。目前对于KCl对酶活性及稳定性影响的研究报道比较多,而对于其他无机盐离子的研究比较少。2.5ph值对酶稳定性的影响通过CD谱可以初步研究蛋白质的二级结构。Johnson等研究了α-胰凝乳蛋白酶在水溶液(pH=6.8)中的CD谱,结果表明α-胰凝乳蛋白酶在水溶液中的二级结构主要是无规卷曲,另外还含有一定量的α-螺旋和β-折叠结构。通过CD谱测定了α-胰凝乳蛋白酶在0.05mol·L-1,不同pH值缓冲液中的二级结构(图5)。由图5可以看出,α-胰凝乳蛋白酶的CD谱在203nm和230nm有最大负吸收。在pH=10.0的缓冲液中,α-胰凝乳蛋白酶在220nm左右的负吸收高于在pH=5.0和pH=7.0的缓冲液中。通常无规卷曲结构在此波段的吸收接近零或有较弱的正吸收,而α-螺旋和β-折叠在此波段均有较强的负吸收。因此,在pH=10.0的缓冲液中,α-胰凝乳蛋白酶在220nm左右的负吸收增强,应该是α-螺旋和(或)β-折叠含量增高的结果。这说明在pH=10.0的稀溶液中,α-胰凝乳蛋白酶的α-螺旋和(或)β-折叠含量要高于pH=5.0或pH=7.0的缓冲液。这一实验结果可能与酶在pH=10.0的稀溶液中的稳定性较高有关(见2.2节),但是pH值对酶的结构与活性中心的影响还有待进一步深入研究与阐明。而α-胰凝乳蛋白酶在0.05mol·L-1,pH=5.0和pH=7.0的缓冲液中的稳定性相差较小,在CD谱上也无明显区别。综上所述,α-胰凝乳蛋白酶在某些有机溶剂中能在24h内维持70%以上的酶活性。pH值对于酶的活性和稳定性有明显的影响,α-胰凝乳蛋白酶在pH=10.0的缓冲液中的稳定性最高,在pH=5.0的缓冲液中其次,在pH=7.0的缓冲液中最低。离子强度在不同pH条件下对α-胰凝乳蛋白酶的稳定性的影响不同。在一定pH条件下的缓冲液中增加离子浓度与强度可提高酶的活性与稳定性。与离子强度相比,离子的类型对α-胰凝乳蛋白酶稳定性的影响较小。上述实验结论对开展在有机相或缓冲液体系中进行酶催化有机反应提供了科学依据。影响酶活性测定和稳定性的因素很多,如温度、搅拌速度等,因此在实验过程中,务必保持条件完全相同,才能获得满意的结果。实验结果表明了蛋白水解酶在有机溶剂中能较长时间保持其催化活性,本研究组已经在上述