基于冰冻铣切技术的大鼠肠道系统高分辨解剖模型的构建

基于冰冻铣切技术的大鼠肠道系统高分辨解剖模型的构建

随着人类科学研究的结束和后基因组时代的开始，科学和学术界越来越多地将生物信息整合到分子、细胞、组织和器官，并将单个、局部、分散和无序数据和信息整合到完整的系统、扩展和挖掘。适应这一需求,出现了高分辨解剖数据集的研究,由于其具有定量计算及数据整合的功能,这为定量研究生理功能及生理建模研究提供了基础,现阶段高分辨解剖数据集已成为国际研究的热点之一,而在解剖集的基础上建立各种生物结构的数字化三维模型则是高分辨解剖数据集研究的重要一环。肠道系统在高等动物体内扮演着非常重要的功能,如食物的消化、营养的吸收、废物的排泄以及参与体内免疫反应;另外,肠道系统内还含有大量的微生物菌群,参与调节肠道内环境、营养吸收、免疫应答等。大鼠是一种常用的实验室小动物,是进行生理及营养学实验的较好的模式动物,其肠道系统常被作为“替代”用于人的肠道的营养、免疫及有益菌群的研究。建立一套高精度的大鼠肠道系统的解剖数据集,并基于此构建出其数字化三维模型,无疑将大大有助于对高等动物肠道系统功能与结构关系的研究。1材料和方法1.1实验动物的准备1.1.1大鼠皮肤急性毒性试验选用150g左右的雄性SD大白鼠(购自华中科技大学同济医学院动物实验中心),大白鼠经肉眼及X-Ray检视,确认无任何损伤,无明显遗传性缺陷、身体健康且匀称方用于试验。实验前用10%的乌拉坦溶液腹部注射大鼠,待其完全麻醉后,用毛剪将其全身披毛尽量剪短,再用7%的Na2S溶液擦拭全身以脱去其披毛。脱完毛后的大鼠用过量CO2安乐处死。1.1.2大鼠的正截面整形处死后的大鼠样本立即进行整形处理,整形的原则是:大鼠的头部,背部及尾部成一条直线,身体两侧基本对称,整形后则将样本转入-85℃冰箱中冷冻固定24h以上,以确保大鼠被彻底冷冻。1.1.3亚甲蓝用量的影响包埋采用新鲜配制的3%的明胶溶液(3g明胶,100ml双蒸水),并加入易与样品区分的染色剂亚甲蓝(0.25g亚甲蓝,100ml明胶溶液)。为了使包埋简单易行,采用了卧式包埋的方式。包埋过程则使用了逐层包埋逐层冷冻的方式。包埋好的样品转入-85℃冰箱中继续冷冻72h以上。1.2样品的预处理图像采集是在特制的小动物切削成像系统上进行。小动物切削成像系统由高精度铣床、成像系统以及制冷设备(-10℃冷库)三部份组成。冷冻好的样品块被固定在铣床载物台上。切削时,样品切削的层厚设置为0.020mm,即每切削一次,铣刀沿Z轴方向向下运行0.020mm;铣床完成一个工作流程的时间定为3min。成像系统则由扫描仪和计算机构成,采用定焦距采集的方式,即扫描仪与铣刀一起运动,每采集一幅图像,立刻通过数据线转移到冷库外的计算机上并存储。切削的整个过程都是在冷库中进行。整个图像的采集采用了连续切削的方式,即24h不停机连续切削。1.3处理完1.3.1好的连续性与保证由于采用了定焦距采集以及连续切削的方式,大多数图像保持了较好的连续性。但是连续长时间切削过程中,机床亦会因为运行异常、人为操作以及机床本身的误差等因素导致少部分图像的不连续,针对这些图像,我们主要根据图像内部的解剖学标志点来进行配准。1.3.2肠道系统图像分割在配准后的图像上选择含有肠道系统的断层切片进行分割。由于冰冻断面上不同部位的颜色分布不均匀,导致自动分割的效果很差,因此,肠道系统的图像分割采用了手工分割的方法,即用Photoshop的套索工具对每幅图像的肠道外轮廓进行分割,分割后的断面见图1。1.3.3并行面建模技术图像重建则采用了面绘制算法,利用VisualC++和VisualizationToolKit(VTK)工具包,基于MPI平台,采用浪潮天梭10000高性能计算集群系统(INFINIBAND版),在并行计算环境中采用Master-Slave模型实现并行面绘制计算,面绘制采用MarchingCubes(MC)算法。2结果与讨论2.1肠道结构的二维特性共获取了高精度的大鼠腹部的冰冻断面图像3000张(单张图片像素大小为0.020mm×0.020mm)。图1为对腹部断面图像上的肠道轮廓分割后获得的大鼠肠道系统解剖数据集的二维图像,图中可见小肠、结肠及盲肠在断面上呈现相互交错的分布,不同的结构可通过颜色将其区分开来,如小肠呈淡红色、结肠则颜色较深,盲肠的颜色则略现暗色。另外,从图中亦可以看出,不同的肠在断面上呈现不同的解剖构造,而这即构成了肠道系统的各部分分工合作的前提和基础。2.2大鼠肠道系统的外观构造图2所示即为对数据集重建后获得的大鼠肠道系统的三维模型。图中用箭头标识了大鼠肠道系统的各部分结构,如十二指肠、空肠、盲肠、结肠和直肠,这些结构相互间紧密盘结,共同构成了大鼠独有的肠道系统的外观构造。2.3数字冰激凌铣切层图像的特征构建解剖数据集及三维模型的方法有多种,较为常见的是利用影像学技术,如CT、MRI等。采用冰冻铣切成像技术的优点是:由于肠道系统的信息直接来源于实物切片,相比于影像学技术,基于冰冻铣切断层图像获得的肠道系统的信息更为丰富、真实。影像学技术中,CT本身就对肠等软组织的成像能力弱,而MRI虽然对软组织的成像能力较强,但也只能成灰度图像,且细节显示能力弱于冰冻铣切图像;另外,影像学技术由于伪影以及重建算法本身的问题,在对身体深层的细小的解剖结构的显示方面存在着一定的困难,而基于冰冻铣切断层图像构建三维模型的方法则能较好地显示各个部分的细节信息。如图1中无论身体内部还是外侧的各个部分的肠的信息都能很清晰地显示出来。而这些因素即保证了最终获得的大鼠肠道系统的解剖数据集及三维模型的“高质量”和“高分辨率”。所构建的数字化大鼠肠道系统高分辨解剖集及三维模型,为从系统的角度、定量地研究高等动物肠道系统的生理功能与结构的关系提供了基础。目前有关大鼠肠道系统的研究较多,主要集中在免疫、营养以及肠道代谢紊乱等与人类健康较为密切的领域,且相关的研究较为分散,而研究的范围又涉及到从微观层次,如免疫分子的基因表达与调控,到宏观层次,如肠道免疫对整个机体的影响等。高分辨大鼠肠道系统解剖数据集的建立,则为整合这些从微观到宏观、分散、无序的肠道系统的数据提供了基础,而数字化三维模型则有助于将这些信息进一步转化为容易接受和理解的形式,从而方便后续的“知识”的发现与“挖掘”。3基于数字化建模的巷道系统整合与结构的分析生命过程的定量研究与系统整合是目前国际上前沿课题之一。基于冰冻铣切