毛两面针药材指纹图谱评价体系的建立

毛两面针药材指纹图谱评价体系的建立

摩擦面针的两个孔是太阳针d.f.快乐sum和exqui套的植物根和茎的两个孔是太阳针的一个孔和一个孔，由两个孔组成。毛两面针含有橙皮苷(hesperidin)、毛两面针素(toddalolatone)、乙氧基白屈菜红碱(ethoxychelerythrine)、氯化两面针碱(nitidinechloride)、木兰花碱(magnoflorine)等多种活性成分。据现代药理学报道,橙皮苷具有增强毛细血管韧性、维持渗透压、缩短出血时间、降低胆固醇等药理活性,是成药“脉通”的主要原料之一;氯化两面针碱和乙氧基白屈菜红碱具有抗炎、抗真菌、镇痛、抗肿瘤、强心等较强的活性作用;木兰花碱具有抗炎、消除运动性疲劳等作用;毛两面针素暂无相关文献报道。毛两面针因其资源分布广泛、植物形态与两面针无明显区别、种植培养难度较小,民间已普遍将其代替两面针使用,广西中药材地方标准也将其收载入册,现已导致各地药材市场两面针品种混乱。为了更好地控制毛两面针的质量,本文对市面上销售的18批药材样品进行指纹图谱研究,并采用相似度评价,系统聚类分析,建立了相应的HPLC指纹图谱评价方法,为评价毛两面针药材质量提供了一定的实验依据。1仪器和试剂盒1.1复合滤材检测Agilent1100高效液相色谱仪(包括G1311A四元梯度泵、G1313A自动进样器、G1315A二极管阵列检测器,美国安捷伦科技有限公司);AG285分析天平(瑞士Mettler公司);KS600D型超声波清洗仪(宁波科生仪器厂);台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂);MS1型漩涡震荡混合器(广州仪科实验室技术有限公司)。1.2药物种及药物毛两面针药材批号及来源见表1,经中南大学湘雅医院药剂科雷鹏副教授鉴定为芸香科花椒属植物毛两面针Z.nitidumf.fastuosum干燥根和茎。对照品橙皮苷(批号110721-201014)、氯化两面针碱(批号110848-200502)、乙氧基白屈菜红碱(批号110847-200601)及毛两面针素(批号111531-200902)均购自中国食品药品检定研究院,木兰花碱(批号BBP01035)购于云南西力生物技术有限公司,其纯度均达到98%以上;乙腈为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。2方法和结果2.1检测条件及进样量色谱柱:PromosilC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:乙腈(A)-0.2%磷酸加0.2%三乙胺水溶液(B),梯度洗脱(0~10min,12%A;10~18min,12%A→23%A;18~30min,23%A→28%A;30~42min,28%A→45%A;42~70min,45%A→85%A);流速:1.0mL·min-1;检测波长:283nm;柱温:20℃;进样量:10μL;理论板数以橙皮苷峰计不得少于5000。2.2对照品储备液的制备精密称取乙氧基白屈菜红碱10.04mg、氯化两面针碱13.24mg、木兰花碱19.13mg、橙皮苷21.26mg、毛两面针素的对照品21.60mg,分别置100mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得对照品储备液;依次精密吸取上述储备液7、10、2、1、5mL,置25mL量瓶中,摇匀,制成混合对照品溶液(浓度分别为53.56、85.04、10.59、4.02、43.20μg·mL-1)。2.3甲醇提取物的制备称取毛两面针药材粉末(过24目筛,45℃干燥至恒重)约0.5g,精密称定,分别置具塞刻度管中;第1次提取,精密加入甲醇10mL,密塞,摇匀,超声(250W,35kHz),提取0.5h后,取出,放冷至室温,离心(5000r·min-1,5min),转移上清液至25mL量瓶中;第2次提取,精密加入80%甲醇同上操作。合并2次滤液,以甲醇定容至刻度,摇匀,静置过滤,取续滤液待用,进样前用0.45μm微孔滤膜滤过,备用。2.4测量分别精密吸取混合对照品溶液与各批次供试品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪中,按上述色谱条件,测定,并记录色谱图。2.5方法研究2.5.1仪器精密度试验称取S1号样品的供试品溶液,连续进样6次,以8号峰橙皮苷作为参照峰S,计算出1~23号共有指纹峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3.0%,表明该仪器精密度良好。2.5.2重复性测定结果分别称取S1样品6份,分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进行分析测定,以8号峰作为参照峰S,考察共有峰相对保留时间和相对峰面积,结果各共有峰相对保留时间的RSD小于1.0%,相对峰面积的RSD小于3.0%,表明该方法重复性良好。2.5.3稳定性试验取同一份由S1号样品制备的供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件分别在0、3、6、9、12h不同时间点进行测定,以8号峰作为参照峰S,考察共有峰相对保留时间和相对峰面积,结果各共有峰相对保留时间的RSD小于1.0%,相对峰面积的RSD小于3.0%,表明供试品溶液在12h内稳定。2.6色谱对照试验按“2.3”项下方法制备18批药材的供试品溶液,照“2.1”项下条件进行测定分析。通过比较各批次药材色谱图,确定了23个特征峰,建立毛两面针药材指纹图谱。将化学信息较多的S1号样品设为典型色谱图,与混合对照品图谱(见图1)对照,指认其中5个色谱峰,分别为木兰花碱(5号)、橙皮苷(8号)、毛两面针素(9号)、氯化两面针碱(10号)以及乙氧基白屈菜红碱(11号),确定8号峰橙皮苷为毛两面针的主要指标成分,将其作为参照峰(见图2)。各色谱峰对内参照峰的相对保留时间定性,计算各色谱峰对参照峰的相对峰面积,若指纹图谱中在某相对保留时间处无峰,则相对峰面积记录为0,仍给予相应峰号,以保证各色谱指纹图谱的完整性将其中第8号峰橙皮苷作为参照峰(见图2)。2.7指纹图谱验证运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件,对上述18批样品进行相似度评价,选择图谱信息较多的S1号药材样品色谱图作为参照,经中位数法进行多点校正自动匹配计算后生成对照图谱。S1~S18号毛两面针样品相似度评价结果分别为0.979、0.876、0.934、0.902、0.973、0.933、0.966、0.986、0.958、0.903、0.955、0.980、0.986、0.932、0.931、0.928、0.899、0.886,可以看出18批毛两面针样品中大多数批次指纹图谱与对照图谱比较,相似度>0.900,少数批次相似度较低,表明该药材可能与储存条件,采收季节,药材加工方法以及选择药用部位有关,其内在质量存在一定差异,需做进一步的分析,进行图谱模式识别分类,以便建立真实可靠的毛两面针药材标准指纹图谱。2.8化学识别2.8.1样品聚类分析将18批毛两面针药材样品作为研究对象,获得23个共有色谱峰,将8号峰(橙皮苷)设为参照峰,规定其相对峰面积为1,其他各峰面积均按相对峰面积折算,将各色谱峰相对于参照峰的峰面积量化,得到18×23阶原始数据矩阵,运用统计分析软件SPSS16.0,采用离差平方和法(Ward’sMethod),利用欧氏距离(Euclidean)作为样品的测度,对其进行聚类分析,聚类分析结果见图3。18批药材样品除S13号外大致可分为两类,一类为S2、S4、S17、S18号样品,其他批次归入另一类。分析S13号样品各成分含量普遍偏低,怀疑药材中掺杂有其他杂质。2.8.2分析样本坐标主成分分析是从多个数值变量(指标)之间的相互关系入手,利用降维的思想,将多个变量(指标)化为少数几个互不相关的综合变量(指标)的统计方法。各毛两面针药材样品经上述实验获得各批样品的色谱数据,以相对保留时间定位,以对应的峰面积的积分值作为数据源,形成23个样本数据矩阵,采用SPSS16.0软件对矩阵进行分析,以主成分PC1和PC2所组成的维投影图见图4。图中每个点对应每批样品,根据各批次投影点与坐标轴距离的不同,可将所有批次分为3个区间:S13号与其他所有批次距离较远,被单独列为一类;另外如图圆圈内所示样品批次投影点较为集中,列为一类;其他批次投影点更加接近PC1,游离主体分布投影群,被视为一类。该统计结果与聚类分析基本一致。2.9指纹图谱的建立根据相似度评价并结合系统聚类分析和主成分分析结果,本实验剔除了相似度低且不具有代表性的S2、S4、S13、S17、S18号样品,选取了13批品种、炮制、贮藏条件均相似或基本一致且经生药学鉴定确定的毛两面针药材,建立其标准指纹图谱,13批样品编号为S1、S3、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S14、S15、S16。将上述13批样品数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件,13批毛两面针的指纹图谱叠加图见图5,标准指纹图谱见图6。相似度计算结果表明,13批样品相似度均>0.900,符合国家药典委员会的要求,可作为毛两面针的品质评价,为完善两面针质量标准的制定提供实验依据。3标准曲线和主成分分析本实验选用具有高灵敏度、精密度及较好的线性范围紫外检测器。经比较,选用乙腈-水(含0.2%磷酸和0.2%三乙胺)作为流动相,采用梯度洗脱方式,能较更多地体现各样品中指纹图谱的化学信息。色谱柱是HPLC系统的核心部件,不同厂家生产的色谱柱可能存在较大差异,本实验考察了WeichromC18(4.6mm×250mm,5μm)、DiamonsilC18(4.6mm×250mm,5μm)、OdyssilC18(4.6mm×250mm,5μm)以及PromosilC18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,结果以PromosilC18的运行结果较好,其基线较稳定,且能更好地丰富色谱信息,能在最短时间以较大程度表现该药材的化学信息。中药样品成分比较复杂,通常采用二极管阵列检测器进行检测,这样有利于最佳检测波长的选择,本实验采用DAD二极管阵列检测器绘制的三维图谱,为了在图谱中不丢失信息,尽可能反映组分全貌,则本实验选用283nm作为测定波长。采用峰面积较大的橙皮苷峰面积作为基准计算相对峰面积,既能表征各成分在同一样品中的相对含量,又能较为客观地反映不同样品中各共有峰所代表的化学成分含量高低,在本文色谱条件下,能同时记录毛两面针中水溶性成分和脂溶性成分的色谱峰,较全面地反映该药材的化学组成。应用系统聚类分析和主成分分析2种化学计量学方法对毛两面针色谱积分数据进行了模式识别的探讨,