丝素蛋白在小口径人工血管中的应用

丝素蛋白在小口径人工血管中的应用

纳米纳米血管,制备双抗凝剂1.关于这个问题的已知信息：目前，大规模合金材料主要是聚丙烯、丝绸和其他材料，因此长期有效性无法得到满足。2文章增加的新信息:丝素蛋白具有生物相容性良好,易于化学改性,有助于内皮细胞定植等诸多小口径人工血管必须的特性。结合最新的纳米材料技术,利用静电纺丝工艺,尝试通过调整电纺参数将丝素蛋白电纺为双层人工血管,从血管整体顺应性、抗凝性及促内皮细胞附着等诸多方面全面强化血管抗凝功能,以获得最理想的远期通畅效果。3临床应用的意义:随着纳米技术、组织工程学的发展,结合最新科技前沿诸如三维打印等技术的问世,丝素蛋白这种理想的生物材料在人工血管制作中的应用必将拥有更广阔的前景。0小口径人工血管的未来人工血管作为一种修复和替代病变血管的假体,是一种非来源于自然器官和组织的血管代用品,亦称为人造血管。目前诸如聚四氟乙烯和聚对苯二甲酸乙二醇酯(涤纶)人造血管已经投入商业量产,并取得满意的远期效果。据统计,聚四氟乙烯及涤纶人工血管(内径≥6mm)5年通畅率分别可达到26%-46%和42%-62%,而动物实验表明,小口径人工血管(内径<6mm)的远期通畅率却只有20%-25%。当今,冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)发病率不断提高,冠状动脉旁路移植作为国际公认治疗冠心病的最有效手段,一直受到自体血管桥取材的限制,如何得到合适的血管假体成为亟需解决的问题。因此小口径人工血管的开发一直是近年来热点研究问题。目前,由于生物相容性材料拥有一系列独特的物理、化学和生物学特性,受到越来越多的关注。其中,丝素蛋白提取自蚕丝蛋白,而蚕丝是中国自古以来就有广泛应用的农产物。蚕丝取材方便,并且拥有理想的组织相容性,优良的机械性能这些人工血管必须具备的特性。中国早在21世纪60年代就开展研制丝质血管,临床应用于腹主动脉替换等已取得较大成功。目前上海丝绸研究所已制成多种类型和不同直径的真丝人造血管。近年来,来自日本及国内众多学者将丝素蛋白应用到小口径人工血管的研发过程中,得到的人工血管拥有较好的抗血栓性及优秀的机械强度,在动物实验中也取得了满意的远期通畅率。文章旨在概述丝素蛋白在小口径人工血管中的具体应用。1小口径人造血管血液分辨率应用计算机检索中国知网、Medline及ScienceDirect数据库1980年1月至2013年12月有关小口径人造血管血液相容性方面的文献,中文检索词为“人工血管,丝素蛋白”,英文检索词为“Vasculargraft,silkfibroin”。1.2纳入研究文献的类型与人造血管研究现状、人造血管血液相容性有关的文献;与丝素蛋白性能及丝素蛋白人工血管制作工艺相关的文献,以及最新人工血管前沿科技信息。重复研究或不相干文章。1.3数据提取共检索到213篇文献,其中中文文献62篇,英文文献151篇,排除与研究目的相关性及内容陈旧、重复的文献159篇,纳入54篇符合标准的文献进行综述。1.4质量评价符合纳入标准的54篇文献中,其中文献介绍了丝素蛋白的应用历史及人工血管的演变,文献[6-10]探讨了丝素蛋白的化学结构及理化性质,文献[11-13]通过细胞动物实验验证丝素蛋白的组织相容性,文献[14-18]探讨了丝素蛋白特殊的抗凝功能及促内皮细胞生长功能,文献[19-23]介绍了丝素蛋白脱胶的普遍方法,文献[24-42]探讨了静电纺丝技术的原理特性及在丝素蛋白人工血管中的应用,文献[43-47]探讨了多层人工血管的研究近况,文献[48-51]探讨了组织工程学人工血管支架中丝素蛋白的应用及特性,文献[52-54]探讨了关于小口径人工血管的最新科研近况及方法。2结果的结果丝素蛋白是理想的人工血管应用材料,静电纺丝技术制作的纳米级丝素蛋白纺丝构成的多层血管将从全方位提升血管的远期通畅率。2.1丝素蛋白生物局域生物结构的调控蚕丝蛋白由丝素蛋白和丝胶两部分组成。丝素蛋白是蚕丝中主要的组成部分,通常通过蚕茧脱胶过滤得到,约占蚕丝蛋白质量的70%。其中丝素蛋白由轻、重两条链构成,相对分子质量分别为25000和325000,两条链紧紧缠绕,结构致密。一般认为丝素蛋白具有从无规卷曲到丝素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型等4种高级结构,这些高级结构具有不同的物理性能,之间可以相互转化。研究表明丝素蛋白构象转变的本质是氢键的重组过程,并且SilkⅠ结构包含水合作用,而转变成SilkⅡ后则不存在水合作用,SilkⅠ结构是丝素蛋白无规结构转为SilkⅡ结构的中间结构。丝素在高湿、高温、高渗,或加入乙醇、甲醇、聚乙二醇等其他物质时容易形成SilkⅡ结构。在多种改变丝蛋白构象的方法中,用醇处理是最直接、简便、有效的方法,已经得到了深入研究和广泛应用。丝素蛋白的这些化学特性,可以通过控制丝素蛋白生成不同的结构及各种结构之间的比例得到不同需要的性能。蚕丝作为外科缝合材料已有几个世纪的历史,但是早期应用蚕丝缝线常导致机体产生较严重的炎症反应和异物反应,之后的研究发现,脱胶处理后的丝素蛋白在体内实验中所引起的机体炎症反应较可吸收外科缝线还要轻微,这就说明分离提纯的丝素蛋白有着优秀的生物相容性。动物实验方面,上海材料研究测试中心在小鼠身上分别对医用丝素蛋白进行了细胞毒性及溶血反应测试,结果表示丝素蛋白无细胞毒性。Dal-Pra将丝素蛋白支架植入大鼠皮下6个月后,显示支架被上皮血管等填充生长,未发现细胞免疫反应发生。这些研究表明丝素蛋白不会引起明显的体内炎性反应,具有良好的生物相容性。丝素蛋白拥有促表皮生长的功能,谢菁等使用丝素膜表面培养猪髋动脉内皮细胞株,结果显示丝素薄膜是对贴壁依赖型内皮细胞的生长具有支持作用的表面材料,并可通过整合酸性成纤维细胞生长因子,增强对内皮细胞生长的促进功能。Yamada等研究发现丝素蛋白膜可促进人皮肤成纤维细胞的增殖生长,并通过分离丝素蛋白分解肽,确定丝素蛋白H链N-末端有2段基序NINDFDED和VITTDSDGNE对人皮肤成纤维细胞增殖有促进作用。Inouye等发现用溴化锂溶解得到的丝素蛋白可以很好地支持人和动物细胞系的黏附和增殖,这主要是由于丝素蛋白序列中的羧基端可以同带有负电荷的细胞表面形成紧密黏合。此外,抗凝作用是小口径人工血管保持通畅的另一个必要因素。丝素蛋白的氨基酸排列是以-(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser)-重叠结构为特征的,其中Ser(丝氨酸)之间的距离,与肝磷脂中硫酸基间的距离十分相近,因此如果在丝素中的丝氨酸上引入硫酸基进行改性处理就可以增加其血液相容性。Tamada报道将丝素蛋白磺酸化后具有抗凝血作用。丝素蛋白分子拥有稳定安全的生物活性,结构已知,自身同降解产物均无生物毒性。可以通过调控化学结构构造不同的物理机械性能以满足特定需求。此外,还拥有促细胞生长,抗凝等诸多优点。可控的机械性能可以调节出合适的血管顺应性,以满足体内动态的血流波动环境,此外,抗凝及促内皮细胞定植能力都是提高人工血管假体远期通畅率的重要性质,并且可以通过共价嫁接功能集团来提高丝素蛋白的血液相容性,方法简单,效果可靠。2.2纳米级纤维纺丝技术丝胶蛋白易于溶于热碱水中,在中国,自古就有用热碱水沸煮蚕丝达到脱胶目的的手法。目前,实验室常用的脱胶溶液主要包括高浓度尿素,中性pH值肥皂水或碳酸钠溶液,还有韩国学者用电解纯水制备出强碱性电解水,其实验证明此电解水可减少脱胶过程对丝素蛋白机械性能的影响。其中最常用的方法将蚕丝蛋白放入2g/L,5g/LNa2CO3溶液煮沸30min,然后用蒸馏水反复冲洗,以去除附着的少量丝胶蛋白。然后放入76-78℃的CaCl-CH-CHOH–HO(moleratio=1∶2∶8)溶液中(另有使用溴化锂作为溶剂),不停搅拌,直至完全溶解。随后应用透析膜反复进行透析,最终可得到丝素蛋白溶液。溶解后的丝素蛋白于去离子水中透析至盐离子完全移除,在室温、鼓风烘箱、冷冻抽干机中可分别制得室干膜、烘干膜及海绵状冷冻膜。Smith等曾偶然于动物实验体内的丝质缝线中发现,体内细胞组织可以透过织物的孔隙在内部结构生长,形成类似于血管内皮的包覆体,从而使修复材料逐渐被机化而不致形成血栓。以此为启发,随后Voorhees等将聚乙烯维萦人工血管成功应用于临床,随后研制出奥纶及尼龙人工血管。随着纤维材料和生物医学材料的不断发展,有孔隙的人造血管不断出现,合适的孔隙有利于内皮细胞快速形成稳定覆盖,以提高血管整体的远期通畅率。现如今生物医学应用材料已逐渐进入纳米级材料范畴,目前大量研究表明,直径接近细胞外基质的纳米级纤维可同内皮细胞形成稳定链接,更能促进内皮细胞增殖生长。Bondar和他的同事分别对比了血管内皮细胞在纳米及微米级纤维丝增殖过程中细胞形态,细胞间接触及黏附分子表达水平的差别,结果显示纳米级纤维组在促内皮细胞定植及细胞与基质交互作用水平方面明显优于微米级纤维组。大量研究表明,促使人工血管的表面尽快内皮化,形成具有功能的完整内皮层可以有效抑制血管狭窄及堵塞的发生。Soffe及Zhang等利用纳米级丝素电纺丝制作出管状血管,体外实验用人冠状动脉平滑肌细胞及人大动脉内皮细胞孵化一段时间后,观察到细胞都有非常稳定紧密的附着。这些都足以证明纳米级纤维可以有效促进细胞生长、黏附和增殖。综上,模拟细胞外基质的纳米级纤维可以有效促进细胞增殖,形成快速、稳定的贴附。而目前,得到近于细胞外基质的纳米级纤维,一般有3种方法-自体组装、相分离和静电纺丝。自体组装及相分离方法一般操作复杂,生产效率较低,所以在推广应用及制作环节限制了其的发展。而静电纺丝技术是一种独特的得到纳米纤维的方法,已日益引起人们的重视,其操作简单,费用低廉,可以大规模量化生产。此外,通过调整静电纺丝过程中的参数,还能可控的将多种聚合材料电纺为直径从几微米纤维到几十纳米不等的纤维。静电纺丝技术最早为Formhals在纳米纤维无纺布的构建中使用,而后该技术才广为人知。其基本原理是使带电流体在静电场中流动与变形,最终得到纤维状物质。一般的静电纺丝机由喷丝头、高压电场、接收器组成,通过喷丝头喷出的电纺液在电场中受力运动形成纳米级纤维纺丝,然后于接收板上获得。可以通过调节注射速率、电场强度、喷丝头距接收器距离等参数得到不同纳米级别直径的纤维纺丝。进行静电纺织,首先需要将丝素蛋白溶解形成电纺液,有学者使用再生蛋白水溶液,也可以将丝素蛋白溶于甲酸或者六氟异丙醇制备出电纺液,进行电纺。但经过研究分析,单纯由丝素溶液进行电纺,得到的纤维机械强度均比原始丝的机械性能有所降低,不能达到人工血管等材料的强度要求。因此有人尝试将丝素蛋白与其他高聚物共纺,以提高血管假体的机械强度,McClure等把丝素蛋白分别与聚己内酯和聚二恶烷酮共混进行电纺,另有使用丝素蛋白同明胶共混,得到的丝素蛋白纤维纺丝抗断强度及延展性能等都有明显的改善。另外,有多名学者在电纺溶液中直接加入肝素钠及促内皮生长因子等来增加血管的血液相容性。Wang等利用静电纺丝技术,将电纺液浓度,电场强度,喷丝流速及喷丝头与收集器之间的距离等参数分别设定为13%,30kV,0.2mL/h,13cm,制作出纳米级人工血管支架,对比了等离子肝素接枝及直接共混肝素钠溶液电纺两种方式处理的人工血管。体外凝固时间实验表明,肝素修饰支架活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间和凝血酶时间均明显优于未经处理的单纯丝素蛋白血管。目前存在多种血管表面改性,包括物理、化学、生物等多种方式,但改性集团同材料之间都难以形成稳固的链接,共混电纺为材料改性提供了一种很好的选择。静电纺丝技术是得到纳米级纤维纺丝的最佳方式,可以通过甲醛、乙醇等后处理增加机械性能,以及共混功能集团改善材料的生物相容性。丝素蛋白取材方便,机械性能良好,目前几种丝素蛋白电纺丝血管,对比胶原等其他常用天然生物材料,无论在抗拉强度上及机械性能方面都表现出明显的优越性。自体血管是由多种蛋白及细胞构成的极其复杂的多层组织结构。不同层分的细胞在维持血管功能机械强度上共同发挥作用,以适应高血流速,以及动态波动压力构成的内部复杂环境。自体血管壁由3层结构组成,分别是血管内膜、平滑肌层及血管外膜。内膜直接与血流接触,由单层内皮细胞构成,是防止血栓形成的主要屏障;平滑肌层较厚,由多层平滑肌细胞构成。针对血管内的复杂环境,已有众多学者尝试制作多层人工血管,以模拟自体血管的抗凝功能、机械强度及弹性等。之前,研究者常在已有涤纶人工血管上采用简单浸渍涂层方法模拟自体血管内膜,密封管壁孔隙,减少人工血管渗漏,同时便于组织的浸润生长和生物性愈合。由于丝素蛋白相比传统材料对成纤维细胞和内皮细胞均有较好的黏附性,取材方便,具有优良的生物相容性,既往有研究应用甲醛蒸汽将丝素蛋白溶液与涤纶血管交联制备人工血管,相比传统涤纶血管可以更快内膜化,同时涤纶血管无明显机械性能损失。同样,在原有机械性能良好血管表面覆膜的技术也是试图模拟血管内皮的抗凝功能,提高血管远期通畅率,国内学者根据肝素抗凝机制在丝素蛋白膜中整合磺酸基团,然后分别利用等离子技术与人工血管交联,体外实验已证明血管的抗凝性明显增强。目前,已有许多学者利用丝素制作出多层人工血管。Michael等利用不同浓度比例的丝素蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白及聚己酸内酯模拟3层血管结构组成,采用分层套管的方法制造出3层血管假体。体外实验中证实其机械性能已接近于最常用于血管置换的自体大隐静脉。国内Liu等研制出的双层人工血管,分别由包含肝素的强化纤维内膜及由高孔隙的丝素外层组成,外层纳米级电纺纤维丝层具有高孔隙,为平滑肌细胞和成纤维细胞的生长提供了合适环境,而内部层丝纤维增强膜可以持续释放肝素,也增强了血管机械性能。体外实验证明其拥有较理想的机械强度、爆破压力、顺应性等。在小口径人工血管中,单层结构难以在抗血栓性、弹性、机械强度上得到全面满意的效果,多层结构更能适应机体复杂的压力动态波动环境。组织工程血管是指通过提供血管细胞种植的三维机制材料,使特定增殖细胞定位贴附生长,分化形成完整的血管3层结构。因此组织工程血管的研究主要集中在定植细胞的研究、支架即细胞外基质替代物的研上。目前常用的支架材料主要有脱细胞基质、生物可降解的高分子聚合物与天然蛋白等。体外酶解及生物酶抑制剂的应用首先,同非组织工程人工血管相同,该材料必须具有生物相容性,在促进定植细胞增殖生长的同时,不能引起局部或全身炎症反应等;其次,该材料血管支架应该具有较高的孔隙率以提供足够的表面积,来承载更多的定植细胞。同时较高的孔隙率可以增强细胞与支架材料间的交互作用;此外,同其他非组织工程血管不同的是,大多数组织工程血管应用材料需要可完全生物降解吸收,并且降解速率需要控制在一定的范围内,过快的降解速率将可导致组织完整性及功能的损失,而太慢的降解速率可能会阻碍组织的正常分化形成。而前文已介绍丝素蛋白拥有良好的生物相容性,体内试验证明无炎性反应发生,表面易化学共价修饰黏附位点和细胞因子以加强定植细胞的生长;可部分生物降解,在体内外降解速率可控,降解产物不仅对组织无毒副作用,还对周围组织有营养与修复作用。Li等使用α-糜蛋白酶、胶原酶ⅠA、蛋白酶ⅩⅩ研究多孔丝素膜的体外酶降解行为发现,不同酶类得到的降解产物稍有不同,半数以上为游历氨基酸。Horan等体外酶类实验表明,丝素蛋白会在一个相对较长的时间内缓慢降解。综上,丝素蛋白是适应组织工程血管制作的理想材料,不仅可以促进细胞增殖,拥有良好的组织相容性及较好的机械性能,并可以在一个相对合适的时间内缓慢降解,为组织生成提供足够的时间。人工血管在材料方面经历有多聚合物到生物大分子,然后是组织工程类血管的建立,而最终目的就是建立可以拥有良好组织相容性的人工血管,在结构和功能上尽可能模拟自体血管。随着近年来材料及制作技术的发展,涌现出大量的新技术,新材料等。三维打印是一种快速成形技术,它以数字化模型为基础,运用粉末状材料,应用黏合剂通过逐层“打印”的方式构造物体,拥有高精度、材料多样性等优点。已有德国学者运用化学高分子材料结合能够有效抵抗排异反应的生物分子制作出了一种特殊的“印刷墨水”,其印制出来的物质经化学反应,然后用密集程度极高的激光脉冲能激发材料中的分子,使其聚集在一个焦点上完成交联,以这种方式研制出高精度,拥有良好弹性结构的人工血管假体。同时为提高血管假体的生物相容性,他们已尝试在血管壁进一步进行分子修饰,并开始研制共混肝素等化学物质的打印墨水,可以在一开始的血管打印中就整合进各种基团,以增强血管的组织相容性。三维打印在人工血管等生物材料制备中有广阔前景。诱导多能干细胞是由日本学者Yamanaka小组将Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这4种转录因子导入小鼠成纤维细胞,诱导其转化成的全能性干细胞。虽然由于诱导多能干细胞自身的安全性问题,到目前为止,诱导多能干细胞还无法应用于临床治疗,但在生物医学领域,对诱导多能干细胞研究的热潮丝毫未减。诱导多能干细胞在血管方面主要是应用其全能性,诱导出血管细胞前体细胞,以分化出完整血管结构。目前,美国学者Samuel等近期已利用人体