石杉碱甲对小鼠足趾肿胀的抗炎作用

石杉碱甲对小鼠足趾肿胀的抗炎作用

胆碱可抗炎道路是指当病原体疾病入侵时，体内的主唾液及其代谢乙酰胆碱（ach）与免疫酶相互作用并参与抗炎。建议的是，这是一种调理植物的千斑灯。它很容易穿过血脑屏障。这是一种可逆、高效、选择性的乙酰胆碱酶抑制剂（achei）。根据研究，在大鼠局灶性脑损伤模型中，石杉碱甲可以显著抑制抗炎细胞因素（如tnf-i和il-1）的过度表达，以抑制缺氧后的炎症反应。因此，石杉碱甲具有抗炎作用。根据pavlov等人的研究，石杉碱甲可以激活胆碱，增加迷走神经的传播脉冲，显著降低内毒素血症减少后的炎症反应，提高其成活率。然而，目前还没有关于石杉碱如何激活胆碱抗炎路的报道。在胆碱对抗炎的道路上，内毒素受体信息可通过迷路神经变动（tnv）转移到模糊的边缘，并通过释放ach来激活模糊的神经变动。因此，假设nts和vmv可以参与胆碱抗炎运动，gagg主枝的异质结。这是gagga作为骨葬蛋白的一种独特成分，是ast的特定标记。这种激活的表现是ast激活的明显迹象。因此，在本实验中，采用免疫组化技术检测了石杉碱甲对急性炎症大鼠干预的影响。mcv、下肢终末化c-fos和星形皮质细胞（gff）的影响，进一步探索了石杉碱甲的抗炎机制。1材料和方法1.1药品及试剂及仪器1.1.1动物昆明种小鼠42只,体重22~24g,雌雄不限,由山东大学实验动物中心提供,每组小鼠单笼饲养,控制室温(20±5)℃,动物自由饮水和摄食.1.1.2主要药品及试剂NaCl由上海青析化工科技有限公司生产;石杉碱甲购自河南太龙药业股份有限公司;兔抗Fos抗体购自SantaCruz公司;兔抗GFAP抗体购自Bioss公司.正常山羊血清购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;SP试剂盒由中杉金桥公司提供.1.2实验动物及免疫组织化学1.2.1石杉碱甲对小鼠炎症的影响取小鼠24只,随机分成4组,每组6只,分别为生理盐水对照组,HupA0.1mg·kg-1、0.3mg·kg-1、0.9mg·kg-1剂量组.用足容积测量仪测量每只小鼠右后肢正常足趾容积,然后腹腔注射给药:①生理盐水组:腹腔注射生理盐水0.1mL;②HupA0.1mg·kg-1、0.3mg·kg-1、0.9mg·kg-1剂量组:小鼠分别腹腔注射20μg·mL-1、60μg·mL-1和180μg·mL-1石杉碱甲溶液0.1mL.30min后,小鼠右后足趾部皮下注射新鲜蛋清0.1mL制作足跖肿胀模型.注射蛋清30min、1h、2h后测量右后足跖容积,计算致炎后不同时间足跖肿胀度和足趾肿胀抑制率.1.2.2石杉碱甲对急性炎症小鼠孤束核、迷走背核及下丘脑室旁核神经元c-Fos和星形胶质细胞GFAP表达的影响18只小鼠随机分为3组,每组6只,分别为对照组,致炎组和0.3mg·kg-1剂量HupA给药组.测量小鼠致炎前正常右后足趾容积,然后腹腔注射给药.其中,HupA给药组腹腔注射60μgmL-1石杉碱甲溶液0.1mL,而对照组和致炎组腹腔注射等容积的生理盐水.30min后,致炎组和给药组制作右后足跖肿胀模型,对照组不予处理.致炎后1h,测量右后足跖容积,随后腹腔注射过量戊巴比妥钠(100mg·kg-1)处死动物.依次用0.01mol·L-1PBS(pH=7.4)和4℃4%多聚甲醛灌流固定.取脑,置入4℃4%多聚甲醛内后固定4h,20%蔗糖磷酸缓冲液(pH=7.4,4℃)脱水过夜.次日行延髓和下丘脑连续冠状冰冻切片(片厚30μm),进行免疫组织化学染色:漂浮切片置于3%过氧化氢/甲醇中孵育30min消除内源性过氧化物酶活性,之后正常山羊血清封闭30min.兔克隆Fos抗体(1∶600,SantaCruz100)或兔克隆GFAP抗体(1∶500,Bioss)4℃孵育24h.生物素化羊抗兔IgG、链亲和素-辣根过氧化物酶复合物中室温下各孵育2h;二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)显色3~5min.各步骤间均用0.01mol·L-1PBS充分漂洗.贴片、脱水、透明、封片.根据小鼠脑定位图谱进行核团定位,利用Imagepro-Plus6.0专业图像软件(MediaCyberneticsInc,MD,USA)统计相应核团内Fos-IR神经元或GFAP-IR星形胶质细胞的数目.1.3统计学处理方法应用SPSS13.0(SPSSInc.Chicago,Ill,USA)统计软件处理数据,各组实验数据均采用平均数±标准差(ue0af±s)表示,组间差异比较采用单因素方差分析(ANOVA)和LSD多重比较.P<0.05为差异有统计学意义.2结果2.1小鼠右小鼠足跖水肿度由表1可知,致炎后30min,HupA处理组小鼠足跖肿胀度均小于生理盐水对照组,其中HupA0.3mg·kg-1和0.9mg·kg-1剂量组小鼠右后肢足跖肿胀度极显著低于生理盐水对照组(P<0.01);致炎后1h,HupA0.1mg·kg-1、0.3mg·kg-1和0.9mg·kg-1剂量组小鼠右后肢足跖肿胀度均极显著低于生理盐水对照组(P<0.01);致炎后2h,HupA0.1mg·kg-1、0.3mg·kg-1和0.9mg·kg-1剂量组小鼠右后肢足跖肿胀度显著低于生理盐水对照组(P<0.05).表明不同剂量的石杉碱甲对蛋清所致小鼠足趾肿胀均有一定的抑制作用.2.2石杉碱甲对急性炎症小鼠足水肿和致炎后gfap表达的影响2.2.1对照组、致炎组及HupA给药组小鼠足趾肿胀度的比较由图1可知,致炎后1h,对照组(0.00±0.00)和致炎组(0.91±0.12)的足趾肿胀度相比存在极显著差异(P<0.01),说明足趾注射蛋清成功建立了小鼠急性炎症模型.而HupA给药组(0.53±0.09)与致炎组(0.91±0.12)相比,足趾肿胀度显著降低(P<0.01),说明石杉碱甲可以显著抑制蛋清致小鼠足肿胀,这与第一部分的结果一致.2.2.2石杉碱甲对急性炎症小鼠孤束核、迷走背核和室旁核神经元c-Fos表达的影响由表2可知,致炎后1h,致炎组与对照组比较,孤束核和室旁核中Fos-IR神经元数目明显增多(P<0.01),而迷走背核中Fos-IR神经元数目增加不显著(P>0.05);与致炎组相比,HupA给药组孤束核、迷走背核和室旁核中Fos-IR神经元数目明显增多,差异极显著(P<0.01)(见图2).2.2.3石杉碱甲对急性炎症小鼠孤束核、迷走背核和室旁核星形胶质细胞GFAP表达的影响由表3可知,致炎后1h,致炎组与对照组比较,孤束核和室旁核GFAP-IR星形胶质细胞数目明显增多,差异极显著(P<0.01);迷走背核GFAP-IR星形胶质细胞数目也有所增加,但差异不显著(P>0.05);与致炎组相比,HupA给药组孤束核、迷走背核和室旁核中GFAP-IR星形胶质细胞均明显增加,差异极显著(P<0.01)(见图3).3石杉碱甲对nts和pvn表达的激活石杉碱甲是一种可逆、高效、高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂.以往的研究表明,石杉碱甲能够明显改善学习记忆能力,临床用于阿尔茨海默病及良性记忆障碍的治疗.Eran等研究发现乙酰胆碱酯酶抑制剂可以抑制多种炎症反应如T细胞增殖,促炎因子产生及CNS炎症等.Pavlov等的研究表明腹腔注射石杉碱甲(0.4mg·kg-1)可以显著降低内毒素血症小鼠血清TNF-α水平,并提高成活率.而本研究发现不同剂量的石杉碱甲均可明显抑制蛋清致小鼠足肿胀(P<0.05或P<0.01),表明石杉碱甲对蛋清致小鼠足肿胀急性炎症也有明显的抑制作用.胆碱能抗炎通路是一种调节免疫系统的神经生理机制,其通过迷走神经释放ACh抑制细胞因子的合成,控制炎症反应.Pavlov等的研究表明石杉碱甲可能通过激活胆碱能抗炎通路,使迷走神经传出冲动增多,而显著降低内毒素血症小鼠血清TNF-α水平,并提高其成活率.但石杉碱甲是如何激活胆碱能抗炎通路的,目前尚不清楚.在胆碱能抗炎通路中,外周炎症信息经迷走传入纤维传递给NTS,NTS将信息整合后激活位于DMV的迷走神经节前神经元,使迷走神经传出活动增多,通过释放ACh调控炎症反应.因此,NTS和DMV可能参与了胆碱能抗炎通路.由于下丘脑PVN与NTS和DMV在结构和功能上存在联系,且有资料表明PVN参与炎症反应,推测石杉碱甲可能通过增强NTS,DMV及PVN的活动而激活胆碱能抗炎通路,发挥抗炎作用.研究发现致炎组足趾肿胀度明显高于对照组,且致炎组NTS,DMV及PVN内Fos-IR神经元数目明显增加,表明NTS,DMV及PVN参与小鼠急性炎症反应.The等研究表明,NTS,DMV及PVN参与肠道炎症反应,与我们的结果相似.石杉碱甲极易透过血脑屏障,且对脑内AChE的抑制强度明显高于对血浆丁酰胆碱酯酶的抑制,可以使脑内ACh水平显著升高而对外周影响不明显.研究发现石杉碱甲对内毒素血症小鼠发挥抗炎作用是依赖于中枢毒覃碱型(M)乙酰胆碱受体的,而注射能够透过血脑屏障的M受体拮抗剂-硫酸阿托品能够消除其抗炎作用.Pavlov等的研究证实,激动中枢毒覃碱型(M)乙酰胆碱受体(特别是Ml亚型),可激活胆碱能抗炎通路,增加迷走神经传出活动并降低循环TNF释放.我们腹腔注射石杉碱甲后,NTS,DMV及PVN内神经元的活动增强,足趾肿胀度明显降低,可能是由于石杉碱甲抑制了NTS,DMV及PVN内AChE的活性,使ACh水平升高,ACh作用于中枢M受体,激活了NTS,DMV及PVN内的神经元,进而激活胆碱能抗炎通路而抑制急性炎症反应.星形胶质细胞是中枢神经系统内数量最多,分布最广的一种神经胶质细胞,目前的研究表明它不仅构成中枢神经系统的基本骨架,而且参与了中枢神经系统内信息的传导与处理,是中枢神经系统功能活动的重要参与者,它能敏感地对各种刺激(包括生理性或病理性刺激)起反应.GFAP是构成星形胶质细胞骨架蛋白的特有成分,为星形胶质细胞的特异性标记物.正常生理条件下,星形胶质细胞为静止状态,表现为胞体小,突起细长,GFAP染色浅淡,阳性率低;因某种刺激星形胶质细胞被激活,即由静止型转化为活动型,其表现是胞体变大,突起变粗,GFAP染色阳性增加,染色加深.那么,星形胶质细胞是否参与调控炎症反应?石杉碱甲是否可以通过影响星形胶质细胞的活动而抑制炎症反应?本实验发现,致炎后除DMV内GFAP-IR星形胶质细胞增加不明显外,NTS及PVN内的GFAP-IR星形胶质细胞均显著增加,且转化为激活状态,胞体变大,突起变粗,表明星形胶质细胞确实参与了炎症调控过程.HupA给药组在致炎前预先腹腔注射石杉