双耳缘静脉留置针诱导的静脉炎模型的建立

双耳缘静脉留置针诱导的静脉炎模型的建立

静脉炎是指长期服用浓度高、刺激性强的药物，或静脉内长期放置刺激性强的塑料导管，导致局部静脉壁出现化学炎症反应。发病率为30%70%。这是临床上静脉输液最常见的并发症。不少学者对输液性静脉炎的防治机制进行了研究,但对静脉炎的形成机制报道尚少。本研究以连续5d20%甘露醇静脉注射造成的静脉炎为基础,建立静脉损伤(Ⅲ级静脉炎)动物模型,旨在探讨静脉损伤及形成机制,为进一步研究防治方法及机制提供参考。1材料和方法1.1材料表面1.2方法2结果3理公中的理法表达变化ICAM-1是黏附分子免疫球蛋白超家族中的一个成员,主要功能是介导细胞与细胞间以及细胞与细胞外基质间的黏附。炎性因子TNF-α的释放可以促进血管内皮细胞和炎性细胞间相关黏附因子ICAM-1的高表达。本研究表1显示,正常兔耳组织中ICAM-1有少量表达,模型组比正常对照组ICAM-1表达量显著增加。Takeuchi等研究也发现,ICAM-1这类分子可以使炎症反应从受创部位皮肤向未受创部位皮肤蔓延,从而促进炎症反应的扩散。综上所述,本研究通过静脉炎动物模型的建立,初步认为静脉炎发生的机制可能与炎性因子TNF-α、ICAM-1表达水平上调有关。但是,静脉炎的形成是一个复杂的病理、生理过程,除TNF-α、ICAM-1指标外,今后尚需进一步探索和研究其他因素与静脉炎发生之间的关系,为静脉炎防治提供更多的理论依据。1.1.1syxk浙选用健康新西兰大耳兔,由浙江省金华市药品检验所提供,许可证号:SYXK(浙)2010-0151,体质量2.0~2.5kg,雌雄不限,兔耳无瘢痕、畸形或损伤。新购买动物先在动物实验中心适应性喂养1周,单笼饲养,饮食活动均正常,无其他系统疾病。1.1.2药物、试剂和仪器20%甘露醇(华润双鹤药业股份有限公司)、生理盐水(安徽双鹤药业责任有限公司)、肝素钠注射液(江苏万邦生化医药股份有限公司)、一次性静脉留置针(美国BD公司)、3M透明敷贴(美国3M公司)、苯巴比妥钠(上海新亚药业有限公司)、TNF-α、ICAM-1多克隆抗体、试剂盒(武汉博士德有限公司)。1.2.1制作静脉留置针按标准选取10只健康新西兰同种家兔,随机分为正常对照组和模型组。模型组5只参照路颜羽方法进行建模,随机编号,单笼饲养,选用美国BD公司生产的Vialon材料24G静脉留置针在兔双耳缘静脉穿刺置管,由专人统一操作,穿刺成功后,注射甘露醇10mL,15min注完,每日注射1次。注射完毕以25U/mL肝素钠溶液正压封管,妥善固定后保留。再次注射药物时,常规消毒肝素帽,将4.5号静脉注射用头皮针刺入肝素帽内,留置5d形成条索状静脉(Ⅲ级静脉炎)后拔除留置针。正常对照组5只,不进行静脉留置针穿刺,但同样进行双耳包扎,共5d。1.2.2静脉炎的分级和分型按照美国静脉输液护士协会(INS)制定的标准,结合动物实验特点,去除评价标准中有关疼痛的指标,将静脉炎分为5个等级:0级,无症状;Ⅰ级,局部红肿或水肿,静脉无条索状改变,未触及硬结;Ⅱ级,局部红肿或水肿,静脉有条索状改变,未触及硬结;Ⅲ级,局部红肿或水肿,静脉有条索状改变,可触及硬结;Ⅳ级,局部红肿或水肿,静脉有条索状改变,可触及硬结。本研究以满足Ⅲ级静脉炎标准为造模成功。1.2.3模型2:比例大,长度低模型组3只建模成功,拔除留置针后,正常对照组5只和模型组3只实验兔均采用苯巴比妥钠腹腔麻醉后取材。正常对照组:取耳缘静脉中段两侧各宽0.5cm、长约3.0cm的矩形标本,从矩形两端分别截取两段0.5cm标本。模型组:以穿刺血管为中线两侧各宽0.5cm,以穿刺点为标记,选取远心端0.5cm、近心端2.5cm共长约3.0cm的矩形标本,截取穿刺点至近心端0.5cm处、留置针套管末端至远心端0.5cm处的两段标本。取材后立即放入10%中性甲醛固定液中固定,送病理科。24h后常规乙醇脱水,石蜡包埋,每个标本连续切片,厚度2~5μm,并分别检测肿瘤坏死因子(TNF-α)、细胞间黏附分子(ICAM-1)表达情况及常规苏木精-伊红染色光镜下观察病理变化。1.2.4观察指标1.2.4.血管周围期滤菌ue0d借助光镜观察血管壁完整性、炎性细胞浸润程度,具体参照赵晓燕等、崔爱荣等、Grüne等对炎症反应的判断标准,分为4个等级:无炎症反应(-),仅见血管周围结缔组织充血水肿;轻度炎症(+),血管周围结缔组织见淋巴细胞、浆细胞浸润,血管壁及血管腔未见炎性细胞;中度炎症(ue0d1),血管周围结缔组织及血管壁各层有淋巴细胞、浆细胞及少许中性粒细胞浸润;重度炎症(ue0d2),血管周围结缔组织、血管壁各层及血管腔可见弥漫性淋巴细胞、中性粒细胞浸润,血管腔内可见较多的渗出物及坏死的细胞碎片。1.2.4.tnf-,icam-1检测采用免疫组织化学S-P法检测,操作步骤严格按照试剂盒说明书进行(TNF-α一抗、ICAM-1一抗均1∶100稀释),染色玻片于显微镜下观察和照相,TNF-α、ICAM-1均以细胞核染成棕黄色作为阳性判定标准。每张切片选取5个高倍视野(×200),每个视野总细胞数不少于500个,计数视野中包括炎性细胞、血管内皮细胞的阳性细胞总数,计算每个视野中的平均阳性细胞数,再计算每组平均每个高倍视野中的阳性细胞数。1.2.5阅读邀请2名经验丰富的病理科医生独立对切片进行评价,该病理科医生事先不知道切片的分组情况,充分避免偏倚的发生。1.2.6统计方法采用SPSS17.0软件进行统计分析,计量资料采用ue0af±s表示,组间比较采用独立样本t检验,检验水准α=0.05。2.1弹性好，好于弹性正常对照组10条兔耳缘静脉清晰,血管软,弹性好。模型组6条静脉满足Ⅲ级静脉炎造模标准,兔耳局部皮肤发红、肿胀,血管变硬,弹性下降,沿血管走向出现条索样改变。2.2炎性细胞浸渍,无炎症反应正常对照组血管内皮连续光滑,血管内皮细胞结构正常,血管壁完整,周围无炎性细胞浸润,无炎症反应(-)(见图1a)。模型组表现为血管壁结构模糊,内皮细胞断裂、脱失,成纤维细胞增生,血管腔内大量炎性渗出物,有血栓形成,血管周围炎性细胞浸润,为中度炎症或者重度炎症(见图1b)。2.3局部静脉tnf和icam-1的出现2.3.1tnf-蛋白表达TNF-α阳性细胞主要为血管内皮细胞、中性粒细胞、浆细胞及淋巴细胞等,免疫组化着色部位为细胞核,DAB显色呈棕黄色。正常对照组TNF-α蛋白低表达(见图2a),模型组TNF-α蛋白表达增加(见图2b)。两组阳性细胞计数比较见表1(每只兔子留取4块标本,最终取标本时对照组5只兔子,即20条静脉;模型组因2只造模失败,弃去,留取标本为3只兔子即12条静脉)。2.3.2小鼠骨髓正常组性免疫指标dab蛋白表达ICAM-1阳性细胞主要为血管内皮细胞、淋巴细胞等,免疫组化着色部位为细胞核,DAB显色呈棕黄色。正常对照组ICAM-1蛋白低表达(图3a),模型组ICAM-1蛋白表达明显增加(图3b)。两组阳性细胞计数比较见表1。3.1%甘露醇是血管内皮功能的枢纽本研究模拟临床输液,先进行静脉留置再输入甘露醇溶液,连续5d即可出现条索状静脉,肉眼观察和苏木精-伊红染色显示中到重度的炎症反应,而对照组无病变,说明药物和穿刺针刺激可共同导致静脉炎。首先,这可能与静脉留置针对血管的机械刺激直接损伤血管内皮细胞有关。Subha等报道留置针阻塞血管加上局部包扎和制动,使血流变慢,内皮细胞的超微结构发生变化,甚至整个细胞失去正常结构,从而增加胶原纤维的暴露。留置针在血管内可改变血流方向,同时注药时对血液产生冲击,形成涡流与湍流,直接损伤内皮细胞与红细胞,后者释放二磷酸腺苷(ADP)可介导血小板活化,导致局部血栓形成。其次,20%甘露醇是一种高渗溶液,以微粒形式存在于溶液中,大量微粒在短时间进入静脉引起血栓,造成局部堵塞和供血不足,组织缺氧而产生水肿和炎症。同时,输入甘露醇时血浆渗透压升高,致使组织液渗透压随之升高,血管内皮细胞脱水,进而局部血小板聚集,并释放前列腺素E1、前列腺素E2,静脉壁通透性增强,白细胞浸润并产生炎症改变,同时释放组胺,使静脉收缩、变硬。Malek等研究发现,甘露醇对血管内皮细胞也可产生直接有害的影响,激活炎性介质和丝分裂素-活化蛋白激酶,直接引发血管内皮细胞凋亡。由此可见,本研究是由静脉留置针机械刺激和药物刺激双重作用导致的静脉炎,其静脉血管损伤的关键原因是血管内皮细胞的损伤,引起的重要变化是炎症反应和血栓形成。3.2家兔耳组织tnf-表达变化TNF-α主要是由单核巨噬细胞所分泌的一种细胞因子,在各种生理病理情况下如细菌感染、肿瘤可大量产生,是一种功能强大的炎性介质。本研究表1