4种医用材料的体外细胞毒性研究

4种医用材料的体外细胞毒性研究

细胞毒性试验对检测医疗材料的毒性是一种相对敏感的方法。由于许多医疗材料的异常毒性试验、刺激试验和移植试验为阴性，因此细胞毒性试验为弱阳性。因此,国外已将该实验作为医疗用品常用的检查项目。细胞毒性实验是利用体外细胞培养方法来评价生物材料和医疗器材或浸提液可滤出成分中潜在的细胞毒性,它是生物学评价体系中最重要的检测指标之一,几乎是各种医疗器械和医用材料临床应用前的必选项目,被列为评价医用器材毒性的重要指标。本实验依据中华人民共和国国家标准GB/T16886.5-2003/ISO10993-5:1999,采用MTT比色法检测4种医用材料的浸提液对L929细胞1,3和5d相对增殖率的影响,评价4种医用材料的细胞毒性。1材料表面1.1扎带、筛网4种医用材料:尼龙线(规格:40支,2股,3000码,西安西京医疗用品有限公司);扎带(规格:2.5mm×100mm,西安西京医疗用品有限公司);筛网(规格:JPP80,西安西京医疗用品有限公司);海棉(规格:10mm,西安西京医疗用品有限公司)。1.2超净工作台scw-hs-400酶联免疫检测仪(RT-6000型,深圳雷杜生命科学有限公司);倒置相差显微镜(XSZ-D2型,重庆光学仪器厂);超净工作台(SCW-HS-840型,苏州市长春电子仪器厂);CO2培养箱(美国Forma公司);可调式微量加样器;25cm2细胞培养瓶、96孔细胞培养板(美国COSTAR公司);无菌滤器(0.22μm)。1.3mtt-3-4,5-四氮唑溴盐的制备培养基:DMEM、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司,用前配成10%胎牛血清的DMEM培养基。消化液:胰酶(Typsin)购自Amresco公司,用前称取125mg胰蛋白酶加50mL三蒸水溶解,配成2.5g·L-1的溶液,用0.22μm的微孔滤器除菌。二甲基亚砜(DMSO)、MTT[3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-四氮唑溴盐]均购自Sigma公司。MTT溶液:用前称取50mgMTT溶于10mLPBS(0.01mol·L-1,pH7.4),用0.22μm的微孔滤器除菌。1.4细胞植物小鼠成纤维细胞系L929购自第四军医大学口腔生物教研室。2方法2.1供试品溶液根据GB/T16886.12-2005/ISO10993-12:2002的方法制备各产品的浸提液。尼龙线:称取供试品2g加10mL体积分数10%DMEM培养基,37℃浸提24h,过滤除菌后即为体积分数100%供试品浸提液,用体积分数10%DMEM培养基2倍稀释即为体积分数50%供试品浸提液。扎带:称取供试品2g,剪成1cm长条后加9g·L-1的氯化钠注射液10mL,37℃浸提24h,过滤除菌后即为100%供试品浸提液,用10%DMEM培养基2倍稀释即为50%供试品浸提液。筛网:将供试品剪成1cm×2cm小块,按120cm2表面积加10mL体积分数10%DMEM培养基,37℃浸提24h,过滤除菌后即为体积分数100%供试品浸提液,用10%DMEM培养基2倍稀释即为体积分数50%供试品浸提液。海棉:将供试品剪成1cm×2cm小块,按60cm2表面积加10mL体积分数10%DMEM培养基,37℃浸提24h,过滤除菌后即为体积分数100%供试品浸提液,用体积分数10%DMEM培养基2倍稀释即为体积分数50%供试品浸提液。阴性对照液:10%胎牛血清的DMEM培养基。阳性对照液:64g·L-1苯酚溶液。2.2培养24h的特点用细胞培养液将对数生长期的L-929细胞配成浓度为4×104个·mL-1细胞悬浮液,每孔100μL接种于96孔培养板,置37℃、5%CO2培养箱中培养24h;吸出每孔中原培养液,每孔加入200μL的阴性对照液、阳性对照液、100%和50%的实验样品浸提液,继续置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养1,3和5d,每组至少设8孔。分别在第1,3和5d各取1块培养板加入MTT20μL(5mg·mL-1)/孔,在37℃体积分数5%CO2孵育箱中继续培养4h后,吸除原液,加入二甲基亚砜200μL/孔,振荡5min后,在酶标读数仪上在490nm波长处测吸光值即A值。3结果3.1计算结果通过公式计算细胞相对增殖率(RGR)。RGR=实验组吸光值/阴性组吸光值×100%。实验结果见表1。3.2结果评估3.2.1细胞形态观察阴性对照组和样品组细胞形态正常,贴壁生长良好,胞浆内有离散颗粒,偶尔可见细胞溶解。阳性对照组细胞基本全部圆缩死亡。3.2.2细胞毒性程度评价于每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况,阴性对照组、样品组细胞生长良好,根据RGR均值,按照细胞相对增殖率评价表评分标准,对样品细胞毒性程度进行评价,见表2。样品组细胞毒性反应均为1级,阴性对照组为0级反应,阳性对照组为3级反应,阴性对照组和阳性对照组的反应符合规定,表明本实验成立。4基亚a法检测细胞毒性MTT比色法是一种检测细胞生长、存活情况的新方法,主要原理是活细胞中的线粒体脱氢酶将MTT分子还原,产生紫色结晶物,用二甲基亚砜溶解紫色结晶体,经比色测定吸光度值(A值),反映材料的浸渍液对细胞数量及活性的影响。此法操作简便,用酶标仪检测,人为误差