创伤后应激障碍大鼠下丘脑内促肾上腺皮质激素释放因子和精氨酸加压素表达的变化

创伤后应激障碍大鼠下丘脑内促肾上腺皮质激素释放因子和精氨酸加压素表达的变化

伤口后的副作用（ptsd）是一种严重的精神反应，如伤口后的复发。研究报道,PTSD患者存在持续低皮质醇反应和一定程度的海马、杏仁核等影像学及形态学改变,以及明显的下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamopituitary-adrenocortical,HPA)轴负反馈抑制作用增强,而促肾上腺皮质激素释放因子(corticotrophinregulatingfactor,CRF)和精氨酸加压素(argininevasopressin,AVP)是HPA轴发挥作用的两个重要因子。因此,我们研究PTSD大鼠下丘脑内CRF和AVP的变化,为进一步揭示PTSD的发病机制提供实验依据。1材料和方法1.1实验动物及分组成年健康雄性Wistar大鼠40只,体质量150~180g(中国医科大学实验动物中心提供),实验室条件饲养,随机分为4组,即对照组及SPS(singleprolongedstress)后24h、7d和14d组,每组10只。1.2方法1.2.1spss方法构建ptsd动物模型采用2005年日本文部省召开的国际PTSD科学会议确定的关于大鼠PTSD模型—SPS。1.2.2脑神经损伤大鼠脑内注射分别对正常及经过SPS处理后24h、7d、14d各组大鼠依次麻醉(2%戊巴比妥腹腔内注射),4%多聚甲醛灌流固定,取脑,于同种固定液中继续固定3h,浸于Holt液(40%蔗糖,0.1mol/LPBS配制)中2~3d至沉下。1.2.3crf-avp抗体小鼠crf和兔抗鼠crf、vep抗体即pa的制备取出各组大鼠大脑,用恒冷箱切片机制作冷冻切片,厚12μm,依次用3%H2O2-DH2O10min、含0.3%TritonX-100的PBS漂洗10min×3,5%BSA封闭20min后,分别滴加兔抗鼠CRF抗体(浓度为1:500,购于博士德公司)和兔抗鼠AVP抗体(浓度为1:1000,购于原平浩公司),0.01mol/LPBS代替一抗作阴性对照,4℃孵育过夜,滴加生物素化羊抗兔IgG37℃、30min,滴加SABC液37℃、20min,以上各步骤间用0.01mol/LPBS漂洗,DAB显色,常规脱水,透明,中性树胶封片。光学显微镜(OLYMPUS,BX60,日本)下观察下丘脑室旁核的表达,摄片。1.2.4血清学标本及其马立克氏体的crf分别取正常及SPS模型处理后24h、7d、14d新鲜下丘脑组织,经匀浆、超声粉碎后高速低温离心,11000r/min,取上清;采用考马斯亮蓝法定蛋白浓度为3mg/ml;每例标本提取蛋白50μg,10%SDS变性凝胶电泳,浓缩胶80V,分离胶120V;转印,40V、95min和100V、120min;TBS浸泡10min,5%脱脂奶粉封闭60min,TTBS中洗2次×5min;,兔抗鼠CRF(浓度1:500),4℃过夜;HRP标记的羊抗兔IgG(浓度1:1500)孵育2h,TTBS洗2次×5min,TBS洗1次×10min,DAB法显色10min,DH2O漂洗,PVDF膜常温晾干后进行定量检测。1.3单、采用anvap/crf/avp模拟CRF和AVP免疫组织化学结果采用ImageJ137图像分析系统,在下丘脑室旁核内测每高倍镜(10×40倍)视野内CRF和AVP的光密度(OD)值,每张切片选7~9个神经元,计算各组平均光密度值。所测数据采用SPSS11.0软件进行统计学分析,数据用表示,各组之间采用ANOVA法进行方差分析,P<0.05表示有差异。Westernblot结果进行图像扫描后分析各条带的光密度(OD)值,统计学分析方法同前。2结果2.1免疫组化的结果2.1.1sps处理大鼠胞浆内crf变化高倍镜下可见下丘脑室旁核中CRF分布于大细胞神经元的胞浆内(图1A),当大鼠经SPS处理后,24h、7d时胞浆内CRF呈上升趋势且均高于正常对照组(图1B,1C),14d时有所恢复(图1D)。2.1.2突变体的动力学高倍镜下可见AVP阳性表达产物主要分布于下丘脑室旁核中神经元、胞体及突起中(图2A)。经SPS后AVP的表达变化基本同CRF,即24h、7d时呈现上升趋势(图2B,2C),且7d时突起中可见明显的串珠样阳性产物,14d后该处神经元的AVP的阳性表达逐渐恢复(图2D)。2.2crf的stranet结果显示SPS后大鼠下丘脑内CRF逐渐升高,7d时最高,14d时回调(图3)。2.3图像分析结果表13ptsd中的体现PTSD是目前备受关注的一种应激性精神障碍性疾病。PTSD患者主要表现为:外周糖皮质激素(glucocorticoid,GC)基础水平降低、海马、杏仁核等处影像学改变以及激惹、易发怒、难以集中注意等警觉性增高症状(在创伤前不存在)。我们已经证实了海马中核受体盐皮质激素受体(mineralocorticoidreceptor,MR)和糖皮质激素受体(glucocorticoidreceptor,GR)对PTSD的影响。因此本文主要研究下丘脑内CRF和AVP的变化,以便了解PTSD病人HPA轴对GC的调节作用。本实验发现,大鼠经SPS处理后,下丘脑内CRF具有增加的趋势。在SPS后24h、7dCRF逐渐升高,14d时有所回调。CRF是调节哺乳动物应激所致内分泌、自分泌和行为反应最重要的神经调质之一。文献证实海马对下丘脑具有抑制作用,抑制CRFmRNA的表达。PTSD患者海马损伤,导致其对下丘脑的抑制作用降低,使下丘脑合成CRFmR-NA增加。我们实验已经证实,PTSD大鼠海马CA1区核受体MR、GR的降低,表明PTSD大鼠海马功能降低,进而对下丘脑的抑制作用减少,下丘脑内GR增加,使下丘脑合成CR增加。BREMNER等通过对比检测PTSD患者与正常人群脑脊液CRF含量发现,PTSD明显增高,提示PTSD患者体内存在HPA轴神经内分泌调节功能紊乱。应激反应受HPA轴和单胺类交感神经系统(sympathicoadrenalsystem,SAS)调控,YEHUDA等研究表明,PTSD患者24h尿平均皮质醇含量明显减少,血浆基础皮质醇水平降低,地塞米松抑制试验显示患者HPA轴负反馈抑制作用增强,推测持续性低皮质醇反应和HPA轴负反馈抑制作用增强。PERVANIDOU等报道PTSD患者血浆儿茶酚胺增多。由此可见,PTSD患者中可能存在着HPA与SAS的“分离”现象,即GC不能限制、调节SAS反应,导致由SAS释放的儿茶酚胺所致的记忆加强。进一步而言,PTSD患者存在着儿茶酚胺反应扩大化以及CRF反应扩大化,这既可使GC受体的敏感性增加而导致GC对HPA轴的负反馈抑制增强,又可通过对认知的影响(如儿茶酚胺兴奋可导致注意分散、高度警觉,激发恐惧,促进记忆等)及致焦虑作用而促进恐惧反应的发展和形成,其中GC亦可在下丘脑以外的脑区上调CRF受体而促进恐惧反应,而导致PTSD。关于儿茶酚胺对PTSD发病机制的作用,目前我们正在进一步研究。另外,我们发现大鼠经SPS刺激后,其下丘脑室旁核AVP的变化与CRF的变化相同。AVP参与了机体包括应激反应在内的多种功能,在HPA轴的调控中对CRF的作用起协同作用。近年来研究发现慢性应激等刺激可以持续刺激中枢AVP的合成和释放,体内的AVP水平明显升高,导致HPA轴功能紊乱。AVP作为神经递质通过V1受体协同CRF刺激外周ACTH和皮质醇的释放来参与应激反应,在HPA轴功能发生紊乱的神经精神疾患中发挥重要作用。HPA轴功能的过度兴奋是AVP释放增多和ACTH对AVP敏感性增加共同作用的结果。此外,一些研究结果证实AVP与动物的记忆有关,AVP的功能改变可产生强迫症状。AVP能调节记忆的生理过程,主要是影响巩固和回忆过程。deKLOET等报道PTSD患者血浆AVP浓度增高。因此认为PTSD大鼠下丘脑室旁核AVP增加与PTSD患者出现的警觉性增高症状(激惹或易发怒、过渡警觉等)、回闪(无法控制地反复回忆起痛苦的创伤事件)有关。