细胞样品RNA的提取

天津益元利康生物科技有限公司联系人：孙经理联系电话胞样品RNA的提取简介获得高质量和完整的RNA是很多分子生物学实验中最重要的一步，当前应用最多的是Trizol/氯仿萃取的方法。原理1、４℃预冷离心机;2、取出培养皿，在超净台中去除培养基，按照每1x107

细胞加入１ｍLTrizol试剂，用枪头吹打充分裂解细胞;3、将细胞裂解液转移到1.5mL无RNA酶的EP管中，向每个EP管中加入（1/5Trizol体积的）200μL氯仿，上下翻转充分混合后，室温静置10分钟，使核酸蛋白复合物完全解离;4、在４℃下12000g离心15分钟;5、离心后，将上层水相（约1/2Trizol体积）小心转移到一个新的EP管，加入等体积异丙醇，震荡后室温静置5-10分钟，然后12000g4℃离心15分钟，弃上清保留沉淀;6、加入1mL75％乙醇清洗并沉淀RNA，12000g离心10分钟;7、弃上清，并重复上述操作一次;8、弃上清，在超净工作台中打开EP管盖，风干5-10分钟，不需完全干燥;9、视沉淀的量，加入10-30μLRNase-Free的DEPC双蒸水中;10、待沉淀溶解后，用nanodrop测定其浓度和纯度并作标记，进行下游实验，多余的RNA保存于-80℃冰箱。用途RT-PCR、分子克隆、Northern-Blot、RNA体外转录与翻译等。材料与仪器【材料】：细胞；Trizol试剂；氯仿；异丙醇；75％乙醇（使用RNase-Free水配制）；RNase-Free水。【物品及仪器】：1.5mlEP管（RNA-free），大，中，小号枪头（RNA-free），移液器，涡旋振荡器，高速冷冻离心机，超净工作台。步骤1、４℃预冷离心机;2、取出培养皿，在超净台中去除培养基，按照每1x107

细胞加入１ｍLTrizol试剂，用枪头吹打充分裂解细胞;3、将细胞裂解液转移到1.5mL无RNA酶的EP管中，向每个EP管中加入（1/5Trizol体积的）200μL氯仿，上下翻转充分混合后，室温静置10分钟，使核酸蛋白复合物完全解离;4、在４℃下12000g离心15分钟;5、离心后，将上层水相（约1/2Trizol体积）小心转移到一个新的EP管，加入等体积异丙醇，震荡后室温静置5-10分钟，然后12000g4℃离心15分钟，弃上清保留沉淀;6、加入1mL75％乙醇清洗并沉淀RNA，12000g离心10分钟;7、弃上清，并重复上述操作一次;8、弃上清，在超净工作台中打开EP管盖，风干5-10分钟，不需完全干燥;9、视沉淀的量，加入10-30μLRNase-Free的DEPC双蒸水中;10、待沉淀溶解后，用nanodrop测定其浓度和纯度并作标记，进行下游实验，多余的RNA保存于-80℃冰箱。注意事项1、过程中需佩戴口罩和新手套，对台面以及周围环境进行灭酶处理，尽量在超净台中进行操作；2、使用无Rnase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。3、溶液配制应使用无Rnase的水，（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度为0.1%（V/V)，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，须小心操作）。4、Trizol裂解液非常危险，因小心避免溅到身上，台面上的Trizol要及时清理干净。常见问题RNA得率过低：1.使用更有效的破碎/匀浆方法。如液氮捣碎、酶消化破壁、电动匀浆