DB36T1846-2023家畜化脓隐秘杆菌病诊断技术规范

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DB36江 西 省 地 方 标 准DB36/T1846—2023家畜化脓隐秘杆菌病诊断技术规范DiagnosticspecificationsforTrueperellapyogenesdiseaseinlivestock2023-09-182023-09-18发布2024-03-01实施江西省市场监督管理局发布DB36/T1846DB36/T1846—2023前  言本文件按照《标准化工作导则第1本文件由江西省农业农村厅提出并归口；本文件起草单位：江西省农业科学院畜牧兽医研究所、赣州市畜牧业发展和动物疫病防控中心。本文件主要起草人：谭美芳、杨群、曾艳兵、李海琴、季华员、谭佳、张帆帆、方绍培、黄美峰、吴诚诚、饶煜玲。IIDB36/T1846DB36/T1846—2023DB36/T1846—20234.2器材器材按GB/T4789.6-2003DB36/T1846—20234.2器材器材按GB/T4789.6-2003中3的规定准备。5临床诊断家畜化脓隐秘杆菌病诊断技术规范范围本文件适用于牛、羊、猪等家畜化脓隐秘杆菌病的诊断、检疫及流行病学调查。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件，（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T4789.6-2003 食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验GB/T4789.28 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB19489 实验室生物安全通用要求NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1化脓隐秘杆菌Trueperellapyogenes3.2化脓隐秘杆菌病Trueperellapyogenesdisease4试剂与器材试剂GB/T4789.28的要求实施。PCRGB/T4789.6-20034章的规定准备。1流行病学临床症状化脓性肺炎病畜体温升高，食欲减退，伴有咳喘、流涕、呼吸急促等呼吸道症状，渐进性消瘦。子宫内膜炎化脓性关节炎病畜精神沉郁，采食量下降，关节肿胀，跛行或不能站立。皮下或肌肉脓肿化脓性关节炎病畜精神沉郁，采食量下降，关节肿胀，跛行或不能站立。皮下或肌肉脓肿颊部、淋巴结等部位可见大小不等的脓包。病理学变化化脓性肺炎子宫内膜炎剖检可见子宫体积增大，宫颈口不同程度的肿胀和充血，宫腔内有脓液，子宫内膜有糜烂或溃疡灶。化脓性乳房炎剖检可见乳腺组织内有大小不等的化脓灶，弥散分布，充满黄白色或黄绿色的脓性渗出物。化脓性关节炎剖检可见关节腔内有脓汁，关节软骨上有黄色干酪样物。25.3.5皮下或肌肉脓肿病原菌的分离培养样品的采集、保存与运输分泌物、脓汁、乳汁、组织等病料样品的采集、保存与运输按照NY/T541的要求执行。细菌分离培养接种菌落形态观察7病原菌的鉴定镜检革兰氏染色阳性，无荚膜，无芽孢，无鞭毛，散在分布，形态不均一的棒状短杆菌。生化鉴定生化试验6.2.2GB4789.2837℃恒温培养18h~24h7病原菌的鉴定镜检革兰氏染色阳性，无荚膜，无芽孢，无鞭毛，散在分布，形态不均一的棒状短杆菌。生化鉴定生化试验6.2.2GB4789.2837℃恒温培养18h~24h。生化特性记录生化试验结果。表1化脓隐秘杆菌生化反应结果3生化试验项目反应结果生化试验项目反应结果葡萄糖+甘露醇－蔗糖－尿素－乳糖+甲基红+半乳糖+吲哚－麦芽糖+硝酸盐－棉籽糖－触酶－果糖+VP－DB36/T1846—20237.2.3结果判定若疑似菌落的生化特性与标准化脓隐秘杆菌生化特性（表1）一致，可确认该菌为化脓隐秘杆菌。PCR鉴定模板制备细菌基因组模板的制备方法，按GB/T4789.6的规定执行。引物序列检测基因是化脓隐秘杆菌保守的特异性基因plo（溶血素编码基因）。上游引物序列：5'-GGCCCGAATGTCACCGC-3'；下游引物序列：5'-AACTCCGCCTCTAGCGC-3'。扩增片段大小为270bp。反应体系每个样品建立25μLPCR反应体系，见表2。用化脓隐秘杆菌标准菌株（ATCC19411）的基因组作为阳性对照，无菌双蒸水作为阴性对照。表2化脓隐秘杆菌plo基因扩增体系配置表试剂名称加样体积（μL）2×TaqPCRMasterMix12.5上游引物（10μmol/L）1下游引物（10μmol/L）1DNA模板2灭菌去离子水8.5PPCR循环条件预变性95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸5min，结束反应，4℃保存。PCR产物电泳配制1.5%5μLPCRDNAmarker作为分子量参考。用凝胶成像系统观察分析电泳结果。结果判定阳性对照扩增出270bp的条带，同时阴性对照未见有PCR扩增条带，检测结果成立。被检样品出现与阳性质控同样大小的条带时，判为阳性；被检样品未出现与阳性质控同样大小的条带时，判为阴性。