il-6在应激性溃疡中的表达及意义

il-6在应激性溃疡中的表达及意义

迎性溃疡是临床上常见的疾病。现有的研究表明,中枢神经递质、神经肽类物质以及下丘脑的某些核团均在应激性溃疡形成过程中起重要作用。已证实,作为机体细胞免疫的主要效能分子-细胞因子,可通过脑-肠轴调节胃酸和粘膜上皮的平衡,参与胃溃疡的形成和保护机制。近年来有关IL-6与胃溃疡关系的研究不多,但在HP感染的胃炎、胃溃疡患者胃粘膜中已发现有IL-6的阳性表达,并证实IL-6参与了炎症过程中粘膜的免疫反应,与溃疡的形成有关。作为一种应激反应的应答因子,IL-6在应激性溃疡形成机制中的作用并不明确。本实验采用WesternBlot和免疫组织化学的方法观察大鼠束缚浸水应激溃疡模型中脑组织和胃粘膜组织IL-6的表达及分布情况,从而探讨IL-6在应激性胃粘膜病变中的作用。1材料和方法1.1bolt试剂盒SD大鼠24只,雌雄不拘,体重180～220g,由第四军医大学动物中心提供。Westernbolt试剂盒为武汉博士德公司提供。蛋白质标准品购自华美公司。兔抗大鼠IL-6多克隆抗体(英国PeproTechECLtd.产品)、兔抗c-fos多克隆抗体(美国SantaCruzInc产品)、EnVisionTMSystem,HRP,anti-Rabbit购自丹麦DAKO公司。1.2方法1.2.1胃指数测定SD大鼠随机分成4组,分别为对照组、应激1h、3h、5h组,每组4～6只。实验前禁食24h,自由饮水。束缚四肢并浸泡于20～23℃的水槽中,水深至剑突。应激后处死。参照以下方法测定胃溃疡指数:出血点得1分;长度<1mm者得2分;1～2mm得3分;2～4mm得4分;>4mm得5分;若宽度>1mm时加倍。所得分之总和,即为该胃粘膜损伤指数。1.2.2根据认知疾病，大鼠脑和胃粘膜组织的蛋白质分析制备胃粘膜及脑组织组织匀浆,采用Westernbolt法进行蛋白质分析。1.2.3渐进性溃疡，大鼠脑和胃组织中的il-6的表达用免疫组化方法检测IL-6的表达,图象分析仪进行半定量分析。1.2.4免疫组化反应和c-fos免疫组化的双重反应将切片进行c-fos免疫组化反应,硫酸镍胺显色,用PBS充分漂洗后继续进行IL-6免疫组化染色,DAB显色。1.2.5统计处理采用第四军医大学统计教研室的SPLM软件对实验结果进行方差分析或用两组均数t检验处理。2结果2.1组织病理学检测HE染色见大鼠应激性的溃疡病变可以发生在胃的任何部位,溃疡形成比较表浅,粘膜上皮脱落,组织水肿,胃腺细胞排列紊乱,溃疡底无肉芽和瘢痕组织,仅有散在的淋巴细胞,单核细胞、中性粒细胞及嗜酸细胞的浸润。2.2应激大鼠应激后il-6表达变化SDS-PEAG电泳可见脑组织及胃粘膜组织的蛋白带分布不同,与正常大鼠相比,应激后均有一些新的蛋白产生,在分子量21～30ku之间有两条新的蛋白带,其中一条的分子量约为26ku,Westernblot采用特异性抗IL-6多克隆抗体证实为IL-6(图1)。2.3应激大鼠肠道il-6免疫反应阳性细胞分布的表达及分布免疫组化染色结果显示IL-6阳性显色为棕黄色颗粒,主要见于胞浆。在中枢神经系统,免疫反应阳性细胞分布于应激大鼠下丘脑水平的神经元和细胞中,在室旁核分布尤为密集,细胞为多角形或小圆形,在视前大细胞核中可见神经细胞细长的突起,多为胶质细胞。在消化道,IL-6免疫反应阳性细胞主要分布于应激大鼠胃溃疡周边、胃组织粘膜下1/3近基底层处,溃疡边缘细胞免疫染色最强,细胞主要是圆形或卵圆形。脑和消化道内IL-6样免疫反应阳性细胞形态多样、大小不等,免疫反应强弱不同,可能反映了细胞功能状态不同和种类的多样性。2.4胃体可以瘘点,胃窦卵圆形,圆形溃疡,出血加重表达的关系束缚浸水应激所造成的溃疡主要分布于胃体,溃疡的产生与时间有关。应激1h可见胃粘膜呈紫红色,轻度淤血,有少量的出血点。以后淤血不断加重,3h即可见明确的胃体线状溃疡和胃窦卵圆形及圆形溃疡,5h出血加重,部分溃疡融合成片状。图像分析和镜下观察发现脑及胃的IL-6阳性细胞数和阳性物质含量呈时间依赖性改变,结果表明,在应激性溃疡的形成过程中,随着应激时间的延长,IL-6的合成增多,胃粘膜的损伤加重(图2)。2.5应激性溃疡大鼠脑c-fos的表达及IL-6和c-fos在下丘脑神经元的共存光镜下观察,c-fos蛋白免疫阳性物质呈深蓝黑色,位于神经细胞核内,以室旁核(paraventricularnucleus,PVN)最为密集,主要存在于室旁核小细胞部,其他部位也有c-fos蛋白的表达但弱于室旁核。双标结果,通过观察和计数,发现约有10%～15%的IL-6阳性神经元细胞表达c-fos蛋白,这类双重反应细胞多呈圆形或梭形,胞核呈深蓝黑色,胞质为棕黄色(图3)。3神经损伤对应激性噬菌等免疫组化的作用近年来研究发现,许多原来由外周免疫细胞产生的细胞因子具有神经生物学效应。在脑内也发现了这些细胞因子的分布,如IL-1、IL-6、IL-3、IL-8、TNF-α等,其表达水平受内环境变化的影响。关于中枢这些细胞因子的来源,有人认为最有可能的就是神经细胞或胶质细胞直接或间接受到外界神经和体液因子的刺激时,本身就能分泌一些细胞因子向中枢传导信息,参与宿主对疾病的中枢控制。已有的研究表明,IL-6不仅具有促进神经细胞生长和中枢的致热作用,而且还与下丘脑-垂体-肾上腺轴的激活有关。我们在实验中发现应激鼠下丘脑IL-6的表达提示中枢内源性的IL-6可能参与了应激过程中某种病理生理机制。神经胶质细胞可认为是脑内的免疫细胞,执行一定的免疫功能,星形细胞为胶质细胞的主要成分。星形细胞受到一些因素影响时可分泌众多的活性成分,如IL-1,IL-6等,这些成分作为免疫介质或炎性介质作用于大脑,参与其免疫生理和病理反应。本实验发现在束缚浸水应激的大鼠下丘脑室旁核中可表达较高水平的IL-6,并且随着应激时间的延长,其相对表达量亦升高,分析中枢IL-6可能通过兴奋某些神经传导机制参与应激性溃疡的形成。目前发现消化性溃疡除在溃疡局部有严重的反应外,同时还伴有胃粘膜的弥漫性炎细胞浸润,细胞因子是介导炎症反应的主要介质。已有研究表明,在非固醇类抗炎药物、Hp感染、应激等导致的急性胃粘膜损伤中细胞因子起着很重要的作用。IL-1、IL-6、IL-8、TNF等在中性粒细胞的趋化、激活、聚集以及溶酶体酶的释放过程中发挥其生物学作用。一些非淋巴样细胞在一定的刺激条件下也可分泌IL-6。本实验发现大鼠胃粘膜IL-6阳性细胞分布于整个粘膜层和粘膜下层,从细胞的形态和分布分析多为巨噬细胞和肥大细胞。在应激性溃疡的形成过程中,粘膜损伤越重,IL-6表达的相对含量越高,说明IL-6与胃粘膜的局部免疫反应有关,它可能参与了应激性溃疡过程中炎性细胞的趋化、激活、和浸润过程。c-fos蛋白作为细胞信使,尽管其作用具有多效性和非特异性,但它作为神经元被激活的标志,仍可有效的用于神经通路的追踪和信使传递途径的研究。本实验发现下丘脑室旁核内c-fos蛋白的强烈表达,提示室旁核在应激反应中的关键性作用,以往的研究表明,损毁室旁核可导致应激反应的基本消失,而电刺激室旁核有加重大鼠应激性胃粘膜损伤的作用,充分说明了c-fos表达和神经元功能变化之间的直接关系。室旁核小细胞部(pPVN)是参与应激反应最重要的核团之一,此处的促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin-releas