心房钠尿肽对压力感受性反射敏感性的影响

心房钠尿肽对压力感受性反射敏感性的影响

许多科学家过去曾关注水生钠尿（anp）中心的调节和心血管活动。静脉注射ANP对压力感受性反射敏感性的影响报道不一,有些学者认为起易化作用,Butler等却认为起抑制作用,也有学者报道无影响。然而ANP不易透过血脑屏障,这些结果不能揭示中枢ANP对压力感受性反射的作用。在中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)中下丘脑是ANP含量最高的部位,其中作为内分泌和自主神经系统整合中枢的室旁核(paraventricularnucleus,PVN)含有高浓度的ANPp,而且其神经元及纤维与血管升压素(vasopressin,VP)神经元及纤维相重叠。但是,PVN内的ANP是否参与心血管活动的中枢调节,若参与其机制是什么,目前还不是很清楚。多数有关心血管活动中枢调节机制的研究是以麻醉动物为实验对象的,但麻醉药本身可以很大程度上影响自主神经的功能,有时甚至可以翻转清醒状态下的心血管反应。因此,本实验利用清醒大鼠,以压力感受性反射敏感性为观察指标,研究了PVN内的ANP对心血管活动中枢调节的影响,进而探讨此过程是否有中枢VP的参与。1材料和方法1.1动物状态恢复工程图1实验选用Wistar雄性大鼠90只(380±20)g,由延边大学医学院实验动物科提供。大鼠用戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉。动物头部固定于立体脑定位仪上,参照Paxinos和Watson大鼠脑图谱,将不锈钢套管(外径0.7mm,内径0.4mm,长19mm)插入到一侧侧脑室(B:0.8～0.9mm;L:1.4～1.5mm;H:2.9～3.0mm)和室旁核(B:1.8～1.9mm;L:0.5～0.6mm;H:6.6～6.7mm),并用牙托粉固定于颅骨。饲养3～5d,待动物状态完全恢复后,用戊巴比妥钠腹腔麻醉,经左侧股动脉将动脉插管插入腹主动脉(SP-31聚乙烯导管接于SP50导管),用于血压监测;同侧股静脉插入静脉插管(硅胶管接于PE50聚乙烯导管),用于静脉给药。术后,将大鼠置于特制的由电脑控制圆形代谢笼(直径为28cm;高度为28cm)内饲养2～3d,待动物状态恢复后进行实验。此代谢笼既可以饲养动物,又可以直接进行实验,有利于减少清醒动物的环境应激;而且它可以有效预防因动物活动而引起的动、静脉导管缠绕,可在动物清醒、自由活动的条件下进行实验。1.2血压及心率测定动物随机分成4个大组,即PVN内注射ANP组(第1组,每小组8只)、静脉注射ANP组(第2组,每小组8只)、侧脑室注射OPC-21268组(第3组,每小组8只)、侧脑室注射OPC-21268同时PVN内注射ANP组(第4组,每小组9只)。第1组又随机分为5个小组,分别为注入3种不同浓度ANP的实验组、注药部位不在PVN的非PVN组、人工脑脊液(artificialcerebrospinalfluid,ACSF)组。第2、3、4组各分为对照组和给药组两组。实验当天,动脉导管经一转动装置连接于MPU型压力换能器,输入到多道生理记录仪(RM-600型,日本光电公司产品)的载波放大器AP-601G上,记录动脉血压,并以血压搏动的微分信号触发心率计数器AT-601G来记录心率。将一不锈钢导管(外径0.4mm、内径0.25mm、长21mm)插入已固定在颅骨的不锈钢套管内,用微量注射器在2min内将0.2μlANP溶液或/和3μlOPC-21268溶液缓慢注入室旁核和侧脑室(第1、3、4组);第2组是将ANP注射到静脉内。实验完毕,动物静脉注射过量麻醉药处死,经电极通以阳极直流电(1mA,10s)进行损毁标记,取脑固定于10%甲醛溶液中,3d后作冰冻切片、染色,鉴定注射部位。1.3压力感受性反射参照Smyth方法,采用静脉注射苯肾上腺素诱发降压反射,以反射前后的心率与平均动脉压变化值之比(ΔHR/ΔMAP,单位bpm/mmHg)作为压力感受性反射敏感性的指标。注射苯肾上腺素前后平均动脉压可增加(26.34±1.25)mmHg,心率减慢(34.86±1.92)次/min,重复性良好。血压变化达不到20mmHg的大鼠不列为实验组。1.4静脉和静脉用药anp的配制ANP为Sigma公司产品,用自配ACSF[配方(mmol/L):NaCl124、KCl2、CaCl22、MgSO42、KH2PO41.25、NaHCO325、glucose11]配制成0.6、6和60ng/0.2μl三种浓度的溶液;静脉注射用的ANP用生理盐水配制成浓度为60ng/0.04ml的溶液。OPC-21268由日本大名制药株式会社创药研究部德岛新药研究所提供,也用ACSF配制,浓度为0.45μlg/3μl。苯肾上腺素为日本名古屋兴和株式会社产品,用生理盐水配制成浓度为0.8μg/0.04ml的溶液。1.5统计处理实验数据用mean±SEM表示。采用单因素的方差分析和团体比较的t检验进行统计。2结果2.1anp的体外注射实验结果表1实验开始前,清醒大鼠的平均动脉压和心率值分别为(135.17±1.87)mmHg和(366.50±9.85)次/min,各实验组之间没有显著差异。PVN内微量注射ANP(0.6、6、60ng/0.2μl)时,各组平均动脉压分别为(134.33±2.04)、(132.80±2.30)、(132.00±1.40)mmHg;心率分别为(370.67±10.91)、(363.00±14.80)、(362.70±12.41)次/min。每种剂量ANP均不引起血压和心率的明显变化(P>0.05)(图1所示以最高剂量为例)。图2中,在用苯肾上腺素兴奋压力感受器的条件下,注射6和60ng/0.2μlANP时压力感受性反射敏感性明显增强(P<0.05),其作用在注射后45min时最为明显,与注射前相比ΔHR/ΔMAP值分别增加(30.32±0.05)%和(49.07±0.11)%,90～100min后可基本恢复到注药前水平。60ng/0.2μlANP组的增强作用明显强于6ng/0.2μlANP组(P<0.05),0.6ng/0.2μlANP组没有表现出对压力感受性反射敏感性的增强作用,非PVN组注射前后压力感受性反射敏感性无明显变化(P>0.05)。2.2动脉和下药适量组的比较静脉注射与核团最大注射剂量相同量ANP(60ng/0.04ml)时,注射前后平均动脉压和心率无显著性差异,分别为(133.17±1.28)、(131.28±1.31)mmHg和(368.17±10.43)、(370.42±12.83)次/min,而且与静脉注射生理盐水组相比,对压力感受性反射敏感性无显著性差异(P>0.05,表1)。2.3acsf对压力感受性反射敏感性的影响实验结果显示,侧脑室微量注射V,受体阻断剂OPC-21268与微量注射ACSF相比,对压力感受性反射敏感性略有抑制作用,但无统计学意义(P>0.05)。90min时其作用仍未恢复到注药前水平(图3)。2.4压力感受性反射敏感性增加如图4所示,侧脑室预注V,受体阻断剂OPC-21268后,室旁核内注射60ng/0.2μlANP,可使室旁核内ANP对压力感受性反射敏感性的增强作用明显减弱(P<0.05)。根据Paxinos和Watson大鼠脑图谱,对所有PVN微量注射部位进行了组织学鉴定,其微量注射部位见图5所示。3anp对压力感受性反射的调节作用本实验以清醒大鼠的压力感受性反射敏感性作为观察指标,研究了下丘脑PVN的ANP在心血管活动中枢调节中的作用。很多研究利用血压作为刺激因素,以心率的反射性变化为效应指标来表示压力感受性反射的敏感性,即通过静脉注射苯肾上腺素引起短暂而快速的升压来诱发减压反射后,测定其反射中的心率和平均动脉压变化值之比(ΔHR/ΔMAP)作为减压反射敏感性的指标。因此,本实验也用此方法来评价压力感受性反射的敏感性。众所周知,麻醉药不仅影响心血管系统和自主神经系统的活动,甚至可以使某些清醒状态下的生理反应发生逆转。因此,本研究利用特制的用电脑控制转动的代谢笼,在清醒、自由活动状态下进行全部实验,排除了麻醉药本身的干扰作用,避免了以往研究因麻醉药影响而出现的分歧。CNS对心血管活动的调节特别是血压的维持主要通过颈动脉窦和主动脉弓的压力感受性反射而实现。孤束核(nucleustractussolitarius,NTS)作为此反射的第一级换元站与PVN之间存在着双向的纤维联系和机能联系,而且已发现很多经典神经递质和肽类物质参与此反射活动的中枢调节。放射免疫和免疫组化研究己证实大鼠下丘脑含有高浓度ANP,在脑干、中脑、大脑皮层、海马等部位也发现ANP免疫活性阳性神经元,其中下丘脑PVN是ANP含量很高的核团之一。因此,我们猜测PVN内的ANP有可能参与压力感受性反射的中枢调节。实验结果表明,PVN内的ANP明显提高压力感受性反射敏感性,与非室旁核组相比具有显著性差异(图3)。为排除所注入的ANP进入循环血液而起作用的可能性,将同剂量的ANP注入静脉未发现其对血压、心率和压力感受性反射敏感性的影响。赵工等实验报道静脉注射ANP明显降低血压;马秀英等用隔离灌流主动脉弓方法,观察ANP可易化大鼠主动脉弓压力感受器活动。这与我们的结果不一致,可能与以下因素有关。(1)用药种类与剂量不同:赵工等用α-hANP3μg/100g,马秀英等用APⅢ2μg/ml剂量灌流,剂量较大;(2)实验条件不同:两者均在麻醉状态下观察;(3)给药途径不同:马秀英等直接灌流主动脉弓。我们的结果提示,PVN内的ANP对压力感受性反射活动具有易化作用,即ANP能提高PVN对血压变化的调节能力。电生理实验指出ANP可抑制PVN神经元的单位放电活动,认为此抑制作用是ANP直接或间接作用于PVN神经元上的ANP受体或对PVN内外兴奋性传入纤维进行调制的结果。Duan等报道,刺激麻醉兔的PVN可抑制被升压反应所兴奋的NTS神经元放电,而一般不影响被升压反应所抑制的NTS神经元放电,提示PVN通过调节NTS神经元放电来抑制压力感受性反射。因此,我们认为ANP可能通过改变PVN神经元活动,而影响NTS对压力感受性反射的调节作用。另外,ANP对压力感受性反射的易化作用出现时间较晚,我们认为ANP可能通过影响PVN神经元的某种蛋白质合成或通道状态的改变起作用,或作为调质影响神经元之间的信息传递过程。Cowley等报道,血管升压素作用于中枢可提高压力感受性反射敏感性。我室也曾观察到在麻醉大鼠侧脑室注射V1受体阻断剂OPC-21268(1.35μg/10μl)明