设计生物化学实验动物组织DNA的提取课件

真核生物组织中

DNA的提取TotalDNAextractionfromeukaryotictissue组员：肖淑娟刘娟娟张小琴主讲人：杨丽苹

1编辑课件真核生物组织中

DNA的提取TotalDNAextra实验目的掌握真核生物基因组DNA提取的一般原理通过动物组织DNA的提取，掌握DNA提取的方法和步骤2编辑课件实验目的2编辑课件动物细胞基因组在提取过程中一般有以下几步:1.首先是机械法破细胞抽提；2.然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；3.最后纯化出ＤＮＡ。3编辑课件3编辑课件DNA提取原则保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑

制作用的物质排除有机溶剂和金属离子

的污染蛋白质、多糖、酚类等降低

到最低程度排除其他核酸分子的污染4编辑课件DNA提取原则保证DNA结构的完整性4编辑课件实验原理DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋白（DNP），能溶解在纯水或1mol/L的NaCl溶液中，而不溶于有机溶剂。十二烷基磺酸钠（SDS），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离。5编辑课件实验原理DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋白（DNP），能溶解在药品试剂与仪器设备药品试剂：动物组织生理盐水SDS三羟甲基氨基甲烷（Tris或三羟甲基甲氨基乙磺酸）EDTA饱和酚氯仿异戊醇预冷无水乙醇75%乙醇蛋白酶K仪器设备：高速离心机冰箱水浴锅微量移液器手术剪刀镊子吸水纸研钵离心管6编辑课件药品试剂与仪器设备药品试剂：动物组织生理盐水SDS三羟操作步骤取新鲜小鼠肌肉组织3g，尽量剪碎，放入离心管中。加入0.45mlTES混匀，再加入50ulSDS，5.0ul蛋白酶K，充分混匀后,60℃水浴保温30-60min，不时颠倒混匀。放置到室温，加入饱和酚500ul颠倒混匀,3000r/m离心10min.吸取上清液到另一个离心管中。加入酚：氯仿:异戊醇（25:24:1）500ul,颠倒混匀。3000r/m离心10min.吸取上清液到另一个离心管中。7编辑课件操作步骤取新鲜小鼠肌肉组织3g，尽量剪碎，放入离心管中。7编5.加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇沉淀DNA,观察现象。6.3000r/m离心10min，弃乙醇。7.-20℃预冷的75%乙醇洗涤，3000r/m离心5min，弃乙醇，55℃干燥DNA.

8编辑课件5.加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇沉淀DNADNA纯化将已提取的DNA粗品加入生理盐水中，再加入固体NaCl使沉淀最少，即DNA溶解度最大。3000r/m离心5min，吸取上清液加入乙醇析出。3000r/m离心5min，弃乙醇得到较纯净的DNA.9编辑课件DNA纯化将已提取的DNA粗品加入生理盐水中，再加入固体Na注意事项选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成，取上清液时注意不要吸起中间的蛋白质。提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少或沉淀物太干燥，都将使溶解变得很困难。酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量。10编辑课件注意事项选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。10编辑课件琼脂糖凝胶电泳检测实验目的

通过实验掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的原理与方法11编辑课件琼脂糖凝胶电泳检测实验目的11编辑课件实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段最为常用的方法之一，这种方法简便易行。而且琼脂糖可以灌制成各种形状、大小和孔径，在不同的装置中进行电泳，如果有必要，还能够从凝胶中回收DNA谱带。

琼脂糖凝胶的分离范围较广，选择不同凝胶浓度和装置，从50个碱基对到几兆不同长度的DNA都可以实现分离。DNA在琼脂糖凝胶中的迁移率受多种因素影响。例如DNA分子的大小；琼脂糖的浓度；所加电压等等。DNA片段越长，泳动速度越慢，而且泳动速度与电场强度成正比。一个给定大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移率不同，DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。

用低浓度的荧光染料如溴化乙啶染色后，凝胶中的DNA可以直接被检测出来。紫外灯下可以直接检测到20pg的双链DNA。12编辑课件实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段最为常用的实验材料

实验器材

水平板电泳槽；灌胶模具及梳齿；电泳仪；55℃水浴；沸水浴；微量移液器

实验试剂

（1）DNA样品；DNA标准分子量标记物；琼脂糖；1x电泳缓冲液TBE；6x样品缓冲液

（2）溴化乙锭：水中加入溴化乙啶，搅拌数小时至溶解。将配好的10mg/ml溴化乙啶溶液装在棕色瓶中，室温保存，使用时稀释至0.5μg/ml。

缓冲溶液配制表缓冲溶液工作溶液储存溶液（每升）TBE0.5x5x0.045mol/LTris-硼酸54gTris碱0.001mol/LEDTA27.5g硼酸20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)6x样品缓冲液0.2%溴酚蓝储存温度4℃50%(w/v)蔗糖水液13编辑课件实验材料实验器材

水平板电泳槽；灌胶模具及梳实验操作1.照厂家说明准备好灌胶模具，置于水平面上（实验操作示意图如下）。

2.配制1%琼脂糖凝胶。取250ml三角瓶，加入100mlTBE缓冲液，称取1克琼脂糖加入缓冲液中，沸水浴加热至完全溶解，然后在55℃水浴中保温。在灌胶模具中插入梳齿，将稍微冷却的凝胶倒入灌胶模具。凝胶厚度3~5mm，避免气泡产生。

3.室温放置30~45分钟，待凝胶完全凝固后，按照厂家说明将凝胶放入水平板电泳槽。4.在电泳槽中加入电泳缓冲液，电泳缓冲液没过胶面1mm，拔下梳齿形成样品池。

5.取样品与6X样品缓冲液按照比例混合后，用微量移液器缓慢加入样品池中。

6.盖上电泳槽并且通电，注意电源正负极，确保样品向阳极移动。恒压1－5V/cm（按照两极之间距离计算），至示踪染料溴酚蓝前沿距离凝胶前端1cm时，切断电源。

7.从电泳槽中取出凝胶，将凝胶置于0.5ug/ml溴化乙啶水溶液中，室温下振摇染色30~45分钟。

8.回收染色液，自来水冲洗凝胶后，于紫外灯下观察。

14编辑课件实验操作1.照厂家说明准备好灌胶模具，置于水平面

15编辑课件

15编辑课件注意事项1.溴化乙啶是一种强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液