蜜蜂黑蜂王台病毒r-pcr快速检测方法的建立

蜜蜂黑蜂王台病毒r-pcr快速检测方法的建立

黑鼠王台湾病是黑鼠王台湾病毒（bqcv）引起的一种黑鼠国王幼虫疾病，在北美、英国和澳大利亚均有发现，并分布在全球范围内。最初在蜂室中受感染的蛹变黑的区域提取病毒,发现了大量等轴单股RNA病毒,呈正二十面体,有4个衣壳蛋白,直径30nm。BQCV基因组全长8550bp,包含2个开放阅读框,5′端的阅读框(ORF1)长4968bp,3′端的阅读框(ORF2)长2562bp。BQCV主要引起蜂王幼虫死亡,在感染蜂小孢子虫体内常携带BQCV,病毒仅在被蜜蜂微孢子虫侵染的蜂王幼虫中增殖。该病导致幼虫死亡发生于前蛹期,虫尸为暗黄色,有一层坚韧的囊状外表皮,类似蜜蜂囊状幼虫病。王台同时变成黑色。在育王群中,由于王台数量大而集中,因此发病率较高。目前用于检测蜜蜂病毒的方法较多,其中最常使用的是免疫扩散法。该法虽然具有快速、廉价和特异的特点,但因其有效的抗血清有限,而且只有制备大量的纯化病毒才能制备与基因库相配的抗血清,因此,该法对实验室研究具有很大的限制。本实验通过对BQCV基因序列的比对,设计特异性引物,应用RT-PCR技术快速检测BQCV,为黑蜂王台病及其他蜜蜂疾病的诊断提供一种新的途径。1.材料和方法1.1蜂种及病毒株来自吉林省不同地区40个蜂场的蜜蜂及蜂产品检疫样品;中国农业科学院蜜蜂研究所病料37份;福建农业大学蜂学院蜜蜂病料20份;蜂种包括意大利蜜蜂、高加索蜜蜂、浙江浆蜂、中华蜜蜂。根据该病特征和免疫扩散试验或ELISA确认为BQCV感染样品,于-80℃超低温冰箱保存。1.2pcr-pcr异丙醇、氯仿、DEPC水、乙醇、TotalRNA提取试剂、MgCl2(25mmol/L)﹑10×RT-Buffer[100mmol/LTris-HCl(pH8.3),500mmol/LKCl]﹑RNaseFreedH2O﹑dNTPMixture(各10mmol/L)﹑RNaseInhibitor(40U/μl)﹑AMVReverseTranscriptase*1(5U/μl)﹑5×PCRBuffer﹑TaKaRaExTaq@HE(5U/μl)和TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0均购自宝生物工程(大连)有限公司。1.3pcr引物的设计根据GenBank中登录的BQCV基因序列(AF183905),在其3′端1000bp区域内设计1对特异PCR引物,序列如下:P1:5′-tggtcagctcccactaccttaaac-3′,P2:5′-gcaacaagaagaaacgtaaaccac-3′,引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。1.4/5naisoregent体积量的确定将3~4只受BQCV感染的蜜蜂放入研钵内,研磨成粉末状,加入适量的RNAisoReagent后,充分匀浆,室温静置5min;加入1/5RNAisoReagent体积量的氯仿,振荡混匀,室温静置5min;4℃,12000×g离心15min,取上清液,加入等体积的异丙醇,室温静置10min;4℃,12000×g离心10min,取沉淀,加入1ml75%乙醇清洗,4℃,12000×g离心5min,取沉淀,干燥,溶解于适量的DEPC处理水中。1.5pcr扩增bqcv基因以提取的病毒基因组RNA为模板,通用引物2μl,逆转录合成cDNA,反应体系为:RNA10μl,5×Buffer5μl,dNTPsMixture(各2.5mmol/L)4μl,通用引物(25μmol/L)2μl,RNase1μl、AMV(5U/μl)2μl,DEPCH2O26μl,共50μl。反应条件为:65℃10min,42℃90min,99℃5min,4℃5min。以合成的cDNA第一链为模板,P1和P2为引物,PCR扩增BQCV基因,反应体系为:模板5μl,10×ExTaqBuffer(Mg2+plus)2μl,dNTPsMixture(各2.5mmol/L)2μl,P1(25μmol/L)1μl,P2(25μmol/L)2μl,ExTaq(5U/μl)1μl,ddH2O7μl,共20μl。反应条件为:94℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃45s,共35个循环;72℃再延伸5min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.6方法验证1.6.1病毒分析方法用建立的RT-PCR法检测蜜蜂急性麻痹病病毒(Acutebeeparolysisvirus,ABPV)、残翼病病毒(DeformedWingVirus,DWV)、蜜蜂囊状幼虫病病毒(Sacbroodvirus,SBV)(均由吉林出入境检验检疫局技术中心实验室保存)cDNA,分析方法的特异性,以BQCVcDNA作为阳性对照,ddH2O作为阴性对照。1.6.2分析方法的敏感性检测将BQCVcDNA定量至1mg/ml,用DEPC水10倍系列稀释,共8个稀释度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8),用建立的方法进行检测,分析方法的敏感性。1.6.3重复验证2.结果2.1bqcv基因扩增的发现BQCV基因PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,可见700bp的特异性条带,大小与预期相符,见图1。2.2方法验证2.2.1增出400b的条带琼脂糖凝胶电泳分析显示,仅BQCV扩增出700bp的条带,而ABPV、DWV、SBV及阴性对照均未扩增出该条带,见图2。表明该方法特异性良好。2.2.2特异性条带的扩增琼脂糖凝胶电泳分析显示,BQCV在10-1~10-7倍稀释后,仍可扩增出700bp的特异条带,见图3。表明该方法的检测灵敏度可达10-7(0.1ng)。2.2.3重复检测结果显示,对相同样品进行多次检测,均在700bp处出现目的条带,表明该方法重复性较好(电泳图略)。3.rt-pcr方法的应用,增强了检测主体对bqcv检测的敏感性迄今为止,蜜蜂病毒的体外培养尚无较好的方法,传统的诊断方法只限于临床诊断和流行病学调查,其准确性、灵敏度均较低。目前检测BQCV常用的技术主要有免疫扩散法、ELISA及强化的化合光免疫印迹法,这些免疫学方法虽然也在应用,但敏感性和特异较低,尤其对多重混合感染难以区别,且费时、费力,个别疾病还缺乏有效的抗血清。因此,迫切需要一种直接快速的方法来解决实际问题。随着PCR和RT-PCR技术的建立及广泛应用,许多研究者已将RT-PCR技术应用于BQCV的检测,并取得了理想效果。本实验根据BQCV全基因组序列的保守序列设计1对引物,PCR扩增700bp的特异性条带,经验证,该法可扩增出0.1ng的BQCVcDNA样品,且特异性和重复性良好。综上所述,本实验建立的RT-PCR方法具有快速、敏感性高、特异性强等优点,可用于快速诊断黑蜂王台病,尤其