硫酸盐还原菌的生态作用

硫酸盐还原菌的生态作用

硫酸还原菌（srb）是一种严格的厌氧菌。它被用作有机化合物化合物的电子受体，并在代谢活动中产生高度稀释的硫酸钠。硫酸盐还原菌有着重要的生态、经济和环境意义。研究表明硫酸盐还原菌参与有机物厌氧降解和低硫酸盐环境中碳的厌氧矿物化,其产生的H2S除了对很多微生物和其他生物有毒害作用,也可以作为一些硫代谢细菌的电子供体;同时由于硫酸盐还原菌产生的H2S、代谢过程中引起油和气体酸化以及细菌和FeS对孔隙的堵塞等原因可造成钢铁、金属等材料的腐蚀,引起工程设施受损。硫酸盐还原菌在倍受关注的甲基汞生物富集过程中起着重要作用,亦参与环境甲苯和二甲苯降解以及可溶性铀和不溶性铀转化。作为自然界中一类生物,硫酸盐还原菌是硫化物转化、物质循环和能量流动中不可缺少的参与者和发动者。随着环境中硫酸盐还原菌研究的深入,要求建立准确可靠的硫酸盐还原菌鉴定和微生物群落结构中硫酸盐还原菌量化分析的方法。本文围绕着对硫酸盐还原菌类群鉴定和量化分析方法作一综述。1盐析还原菌的分离纯化硫酸盐还原菌分离纯化方法应用较多,多采用选择性培养基进行厌氧培养,常用的培养基为RP-38肉汤。硫酸盐还原菌大部分为中温性细菌,最适温度为30℃,但部分嗜热菌要求55℃生长,培养时应根据菌株的温度型选择培养温度。硫酸盐还原菌在pH5~9.5的范围内生存,最适pH值为7.0~7.8。取自高盐环境样品在进行硫酸盐还原菌培养时,还应加入2.5%的NaCl。硫酸盐还原菌厌氧培养时所用培养基的氧化还原电位(Eh)要求在-100mV以下,通常添加巯基乙醇或抗坏血酸作为还原剂以获得较低的氧化还原电位。同时培养基中加入的亚铁盐可以与硫酸盐还原菌代谢过程中产生的H2S形成FeS黑色沉淀,在固体培养基上可形成黑色菌落或菌落周围形成黑色沉淀环,液体培养基则表现为黑色混浊或沉淀成长。硫酸盐还原菌分离纯化培养可以得到纯化菌株,有利于对菌株进一步分析。但该法只能选择性地培养出硫酸盐还原菌某些类群,且分离培养后菌株的生理特性易发生改变等,有时并不能说明样品的真实情况。选择适宜的培养基、正确的样品预处理和严格的厌氧实验条件是硫酸盐还原菌分离纯化培养获得成功的关键。2ssr-rflp基因及pcr-rflp和原位杂交建立于检测硫酸盐还原菌遗传标记基础上的分子生物学方法主要有PCR、PCR-RFLP和原位杂交,常用的遗传标记主要有硫酸盐还原菌16SrRNA基因特征序列和硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶(dissimilatorysulfitereductase,dsr)基因。2.1利用16srrna基因分析PCR(polymerasechainreaction)技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,其目的是将微量DNA大量扩增。PCR方法被广泛应用于硫酸盐还原菌的鉴定和检测中,所用引物多是依据硫酸盐还原菌6个主要类群的16SrRNA基因特征性序列而设计的,也有利用PCR对硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶基因分析的报道,MichaelWagner等对多种属于真细菌和一种属于古细菌的硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶基因进行PCR扩增,对扩增产物进行碱基序列分析,并进一步推导出亚硫酸盐异化酶氨基酸序列进行比较,结果表明硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶氨基酸序列有高度相似性(49%~89%),从而推断出属于真细菌和古细菌的硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶可能起源于同一个保守的酶。PCR敏感性高、实验方法较为成熟,近几年被广泛应用。但如何解决环境样品核酸提取和PCR对混合DNA样品中某些模板的优先扩增等问题是成功应用PCR于硫酸盐还原菌鉴定和检测的关键。2.2利用rflp进行基因分析RFLP即限制性片段长度多态性,是根据限制性核酸内切酶具有识别并切割目的DNA特殊碱基序列的特性,利用特定限制性核酸内切酶对目的DNA进行消化。由于目的DNA碱基的突变或种属之间的差异可能会使酶切位点增加或减少,从而使酶切片断的数量和大小发生改变,可以在一定程度上反映出目的DNA分子的序列信息。得出的限制性酶谱亦可以与标准菌株比较,进行微生物的鉴定。RFLP常和PCR合用,利用RFLP对PCR产物进行消化,即所谓的PCR-RFLP。常选用硫酸盐还原菌SRB385基因片段和dsrAB基因片段进行PCR-RFLP,来进行硫酸盐还原菌特定基因的多态性分析或类群鉴定。SRB385基因是δ群变形杆菌纲的微生物(包含大多数硫酸盐还原菌)16SrRNA基因385~402bp保守核酸序列,依据该基因建立的分子生物学方法所检测的微生物常特指硫酸盐还原菌所有类群。dsrAB基因编码硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶,同一类群的硫酸盐还原菌中相当保守,在不同类群中却有较大差别,可以作为硫酸盐还原菌的分类与进化的指标。XueduanLiu等利用PCR-RFLP分析了东太平洋海洋沉积物中的硫酸盐还原菌dsrAB基因多态性,表明该基因的分子多态性即硫酸盐还原菌类群多态性与海洋的深度、碳源生物利用度密切相关。PCR-RFLP有很高的分辨率,结果的重复性和准确性也较高;不足之处是操作步骤繁琐,有较高的技术要求。2.3细胞原位杂交核酸分子杂交技术是利用特异性探针对微生物的核酸序列进行检测,从而分析微生物群落结构、分布模式、丰度和特定微生物类群。杂交所用的探针多采用依赖16SrRNA序列设计的寡核酸探针,杂交方式通常有菌落杂交、斑点印迹杂交和原位杂交,以斑点印迹杂交和原位杂交较为常用。斑点印迹杂交(dotblothybridization)通常是提取并点样于滤膜上的微生物16SrRNA与标记探针杂交,从而进行定性和定量分析。定量斑点印迹杂交检测过程中常应用2种以上寡核苷酸探针,分别是测定所有微生物的通用寡核苷酸探针和特定微生物的特异性寡核苷酸探针。样品杂交后信号强度与定量培养物制备的检测标准曲线进行比较,可以将测定信号转化为细胞数。该法已被应用于硫酸盐还原菌定量检测中。定量斑点印迹杂交所用的探针常以放射性核素进行标记,具有较高的敏感性;同时16SrRNA是细胞内的可测产物,其含量可以代表特定微生物群体的生理活性。但不同种的微生物体内含有不同数目的核糖体(103~104),甚至是同一菌株在不同的生长阶段其核糖体含量也不相同,使该方法在运用中存在一定的问题。目前应用较多的核酸杂交技术是原位杂交技术(insituhybridization),这里的原位杂交技术是指不改变细胞形态和微生物小环境进行的杂交。利用rRNA序列探针进行原位杂交,最早的标记物是核素,该方法需要较长时间的曝光和环境的污染。近几年荧光素标记的寡核苷酸探针被广泛应用于原位杂交中,即所谓的荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)。该法是通过荧关素标记依据rRNA(主要是16SrRNA)设计的寡核苷酸探针,后者与固定在玻片或纤维膜上的组织或细胞中特定的核苷酸序列进行杂交,结果可直接在荧光显微镜下观察。近几年有了很多的根据16SrRNA设计的群和属的寡核苷酸探针进行微生物群落结构和硫酸盐还原菌类群的分析。EnricLlobet-Brossa利用氰盐(Cy3)标记特异性寡核苷酸探针的荧光原位杂交,研究了德国北海WaddenSea沉积物不同垂直度的微生物群落结构。结果表明一定垂直度的沉积物中,硫酸盐还原菌占总微生物的量仅次于黄杆菌属。原位杂交技术不仅可以量化样品中的硫酸盐还原菌,而且还可以分析硫酸盐还原菌在样品中的空间分布和动态变化。该方法也存在着一定的缺点,首先是敏感性较低,硫酸盐还原菌小于103/cm2时,视野下检测信号就较少。对于这样的标本通常使用过滤的方法,对微生物进行富集;其次是低信号强度时待检测的目的分子较少,有增加探针非特异性杂交的可能性;此外,不同生长阶段的微生物细胞内的rRNA含量也不同,造成了同种细菌的信号强度不同。3荧光标记抗体检测基于生物特征化合物的测定方法主要有微生物多胺法、生物醌图谱法和免疫标记法等。以免疫标记法较为常用,标记物常为荧光素和酶。硫酸盐还原菌鉴定和分析方法主要有直接荧光抗体法(IFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。前者利用荧光标记的特异性抗体即所谓的免疫荧光探针,对硫酸盐还原菌菌体表面或菌体内特异性抗原进行定性或定量检测;同时免疫荧光探针可以产生很好的空间定位,可以通过荧光显微镜分析样品中硫酸盐还原菌的空间位置。后者是基于检测硫酸盐还原菌菌体中的腺苷酰硫酸还原酶(adenosine-5′-phosphosulfatereductase,APSreductase)的理论建立起来的一类方法。生物特征化合物的检测方法最小检测限度为103~104cell/cm3,限制了硫酸盐还原菌较低浓度标本的检测;同时由于标本中硫酸盐还原菌残片可以作为游离抗原,对IFA检测方法造成干扰;其他种属的细菌体内也有腺苷酰硫酸还原酶的存在,降低了检测该酶的ELISA方法特异性。4菌株的进一步分析对环境