荧光原位杂交技术检测污水中硝化细菌的条件优化

荧光原位杂交技术检测污水中硝化细菌的条件优化

硝化细菌是一种具有优良耐腐蚀性的革兰氏阴性菌，包括亚硝化细菌和硝酸菌。这对促进氮素的整个循环和从废水中清除氮具有非常重要的意义。因此，我们不仅可以监测水质的变化，还可以监测环境中数量的变化对氨氮的去除效率起到指导作用。检测硝化细菌的传统方法不但费时费力,且细菌计数困难、不准确.随着分子生物学技术的发展,分子生物学方法已经成为现代环境微生物学的重要手段.荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)技术的原理是dsDNA变性后和带有互补序列的同源单链退火配对形成双链结构的过程.退火复性形成的可以是双链DNA或DNA/RNA异质双链分子,带有荧光标记的探针与固定在玻片或纤维膜上组织或细胞中特定的核苷酸序列进行杂交,探测其中所有的同源核酸序列,结果直接在荧光显微镜下即可观察,无需单独分离DNA或RNA.该技术特异性和灵敏度极高,具有传统方法不可比拟的优势,使研究环境中那些数量少,培养难度大的微生物问题得以解决,并可提供环境微生物数量和空间分布等多种信息.国外应用FISH技术研究活性污泥或生物膜中硝化细菌分布的研究较多,通常根据样本中荧光面积相对大小表示细菌存在情况,由于对环境样本没有进一步处理,使定量结果有一定的局限性.本文重点探讨环境样本硝化细菌定量监测中FISH技术的应用,并筛选出FISH技术用于环境硝化细菌检测的最佳条件,从而使环境硝化细菌定量监测更快、更准确、更简便.1材料和方法1.1fish法测定了硝化细菌的步骤1.1.1玻璃处理11玻璃清洁热肥皂水刷洗,1%(质量分数)盐酸浸泡24h,再在0.1%(质量分数)焦碳酸二乙酯(DEPC)中浸泡24h.2硅化处理玻片和盖玻片1%(质量分数)盐酸煮沸10min,烘干,锡纸包好4℃保存备用.31明胶膏将烘干的玻片放入明胶中10min,然后60℃烘干过夜备用.1.1.2样品采集和预处理1样品的制备和固化用0.1%(质量分数)DEPC浸泡的聚乙烯管子采样;4%(质量分数)的多聚甲醛于4℃固定4h;将固定样本用磷酸缓冲液离心漂洗2次,用w(PBS)∶w(乙醇)=1∶1液稀释备用;10μL的样品涂于包埋明胶的玻片,37℃的烘箱热固定;依次用50%,80%,96%(质量分数)乙醇室温下脱水.2水质水样直接按1∶1加入4%(质量分数)的多聚甲醛,4℃固定4h,用苏丹黑B染色,硝酸纤维膜过滤后,进行热固定、脱水等处理步骤.1.1.3sse-lssds和1.2.7.7.3.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7重组病毒杂交.6.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7亚硝化细菌探针和硝酸菌探针见表1.密闭杂交盒里放吸水纸,杂交液湿润.载玻片上加入24μL的杂交液和1μL探针,加盖玻片,杂交盒内进行杂交反应.杂交温度与杂交时间经正交试验确定.探针质量浓度均为50ng/μL.杂交液配制:SDS0.1%(质量分数),Tris-HCl(pH8.0)20mmol/L,NaCl900mmol/L,硝酸菌杂交液含去离子甲酰胺(DAF)40%(质量分数);亚硝化细菌杂交液含去离子甲酰胺(DAF)55%(质量分数).1.1.4洗脱探针的配制杂交盒中取出载玻片放入48℃杂交洗脱液20min后,ddH2O漂洗,晾干.洗脱液配制:Tris-HCl(pH8.0)20mmol/L,SDS0.1%(质量分数),洗脱探针NIT3时EDTA56mmol/L,洗脱探针NSO190时EDTA20mmol/L,NaCl浓度经正交试验确定.1.1.5硝化细菌数目玻片在荧光显微镜(NIKON-26188)下观察,滤光片为B光源.阳性为橙色、绿色,观测30个视野记录硝化细菌数目.细菌丰度(cells/g或cells/L)为AS1/(S2V),其中,A为视野中细菌平均数;S1为样品涂抹的面积;S2为视野面积;V为样品体积.1.1.6比较阴性对照:样品进行杂交,杂交液中不含探针.阳性对照:标准亚硝化细菌和硝酸菌.1.2硝化细胞检测条件的优化设计1.2.1a因素设计水平选用L9(34)正交表做试验.优化因素:Aa为热固定时间因素;Ba为乙醇脱水时间因素.Aa因素设计3个水平:Aa1a1=1h,Aa2a2=2h,Aa3a3=3h;Ba因素设计3个水平:Ba1a1=3min,Ba2a2=5min,Ba3=7min.杂交条件依照亚硝化细菌正交优化的条件进行,同时考虑Aa,Ba间的交互作用,相同实验条件下重复3次.1.2.2ssr-cb法选用L9(34)正交表做试验,硝酸菌NIT3探针优化因素:Ab为杂交温度因素;Bb为杂交时间因素;Cb为洗脱液中NaCl浓度因素.Ab因素设计3个水平:Ab1=46℃,Ab2=37℃,Ab3=55℃;Bb因素设计3个水平:Bb1=3h,Bb2=1h,Bb3=5h;Cb因素设计3个水平:Cb1=60mmol/L,Cb2=300mmol/L,Cb3=540mmol/L.不考虑Ab,Bb,Cb间的交互作用,相同实验条件下重复3次.亚硝化细菌NSO190探针优化因素:Ac为杂交温度因素;Bc为杂交时间因素;Cc为洗脱液中NaCl浓度因素.Ac因素设计3个水平:Ac1=46℃,Ac2=37℃,Ac3=55℃;Bc因素设计3个水平:Bc1=3h,Bc2=1h,Bc3=5h;Cc因素设计3个水平:Cc1=20mmol/L,Cc2=60mmol/L,Cc3=100mmol/L.不考虑Ac,Bc,Cc间的交互作用,相同实验条件下重复3次.1.3细菌培养和检测初步确定亚硝化细菌与硝酸菌检测条件的基础后,对太湖的梅梁湾、玄武湖凌州水样以及南京锁金村污水处理厂的活性污泥进行样本中硝化细菌的检测与比较.相同实验条件下每份样品重复5次.2结果与讨论2.1结果2.1.1影响因素的选取从表2看到,RAa,RBa,RAa*Ba分别为0.115,0.062,0.045,从极差值大小来看,主要影响因素是Aa因素,其次为Ba因素;Aa*Ba交互作用极差值大于0,说明二者存在交互作用.考虑到Aa,Ba因素之间存在交互作用,再做析因分析,得到热固定2h,乙醇脱水3min为最佳水平搭配.因此,最佳的样品预处理条件为:热固定2h,乙醇脱水3min.2.1.2极差值分析从表3看到,RAc,RBc,RCc分别为0.399,0.111,0.098,从极差值大小可知,对结果影响大小依次为Ac,Bc,Cc.根据极差值分析得到亚硝化细菌杂交反应较好水平搭配为:杂交温度46℃,杂交时间3h,NaCl浓度20mmol/L.2.1.3种杂交试验结果从表4看到,RAb,RCb,RBb分别为25.25,25.19,7.2,从极差值看Ab,Bb因素对实验结果的影响大于Cb因素.极差值分析认为较好水平搭配为:杂交温度46℃,杂交时间5h,NaCl浓度60mmol/L.由于正交试验中没有涉及到这种水平搭配,而从正交试验结果看杂交温度46℃,杂交时间3h,NaCl浓度60mmol/L为较好水平搭配.因此,再对这2种组合同时进行实验,进一步对优化条件验证.结果经t检验,按α=0.05水平,这2种水平搭配对实验结果的影响具有统计学意义(p<0.05).2种条件下测得的硝酸菌平均值分别为(1.13±0.16)×107和(0.96±0.07)×107cells/g.由此,硝酸菌的最优杂交条件为:杂交温度46℃,杂交时间5h,NaCl浓度60mmol/L.2.1.4群落微生物环境应用本研究确定的优化条件,对太湖、玄武湖水及南京锁金村污水处理厂活性污泥中硝化细菌进行检测,结果见表5.由表5可以看出,太湖、玄武湖水中的亚硝化细菌数量比硝酸菌低一个数量级,这是否反映该类水体的微生物含量不利于氮的转化,还需要研究玄武湖的硝化细菌数量与富营养化水体关系,以及硝化细菌数量与NH+4-N,NO-3-N含量和相关环境因素的关系.活性污泥中亚硝化细菌数量较低,微生物环境不利于氮的去除.2.2硝酸盐发酵组合研究结果显示,样品处理中,热固定因素对结果有明显影响,当固定的时间为2h时,样品与明胶的粘附效果最佳,最有利于检测,并且热固定与乙醇脱水时间存在交互作用.因此,样品预处理较优的条件为热固定2h,乙醇脱水3min.在FISH试验中杂交温度、杂交时间和洗脱液中NaCl浓度对结果都有一定影响.杂交时间与杂交温度均影响探针的特异性,在一定温度范围内提高杂交温度可以提高探针特异性;杂交时间过短会造成探针结合不完全,杂交时间过长会增加非特异性着色;杂交洗脱液NaCl浓度过高可降低探针的特异性.本研究显示,硝酸菌较好的杂交条件组合为杂交温度46℃,杂交时间5h,NaCl浓度60mmol/L;亚硝化细菌较好的杂交条件组合为杂交温度46℃,杂交时间3h,NaCl浓度20mmol/L.亚硝化细菌和硝酸菌数量是水体中氮循环进程的重要指标,与NH+4-N和NO-3-N含量之间存在相关关系.水体中氮循环的改变会导致水体化学特征的改变,进而使硝化细菌群落在种类和数量上随之发生改变.硝化细菌的这种改变直接反映了所处水体的氮循环状态,对反映水体富营养化程度具有重要意义.目前西湖、玄武湖、东湖处于中富营养化状态,太湖处于轻富营养化状态.从已报道资料看,西湖、太湖、东湖水中亚硝化细菌数量基本上比硝酸菌低一个数量级.有关杭州西湖的资料报道,水体中硝酸菌和亚硝化细菌数量分别为3.2×103cells/mL和5.85×103cells/mL.本研究中应用FISH技术测得玄武湖与太湖的硝酸菌(103cells/mL)和亚硝化细菌数量(103cells/mL)相当,二者的亚硝化细菌数量比硝酸菌也低一个数量级.可见,亚硝化细菌含量普遍低于硝酸菌含量是富营养化水体的一个共同特征.有研究认为,在湿地以及除氮效率比较高的水生高等植物群落内的亚硝化细菌数量比硝酸菌高2～3个数量级,这表明湿地的环境条件更适于亚硝化细菌大量生长,从而提高氮的去除.南京锁金村污水处理厂活性污泥中亚硝化细菌、硝酸菌含量较低与该污水处理厂没有脱氮工艺,缺乏硝化细菌大量繁殖的环境条件有关.但是环境条件与硝化细菌分布、数量和脱氮相互之间的关系还需进一步研究.利用FISH技术研究水体中的硝化细菌数量与NH+4-N和NO-3-N相关性,可以准确快速地对水体中硝化细菌的数量进行监测,评价水体的氮循环状态,