小麦耐盐性种质的筛选

小麦耐盐性种质的筛选

盐渍是作物生产中常见的自然劣势之一，尤其是在干旱和半干旱地区。盐渍化土壤在世界上分布很广,我国大约有6×106hm2的盐碱地。培育耐盐碱的植物品种是改良和利用盐碱地资源比较经济、有效的措施之一,它对盐碱地区尽快建立合理的地貌结构,加速抑盐脱盐进程,提高作物产量都具有重要意义,可能是长远而有效地利用盐渍化土壤资源的一条根本途径。近年来,国内外在植物的耐盐性方面开展了大量工作,研究了植物耐盐性的生理机制,探讨了其遗传规律,对许多作物品种资源进行了耐盐性的筛选。但相对于其他性状而言,进展还很缓慢,有些生理机制还不清楚。对于小麦耐盐性的研究多集中在小麦的近缘种属上,因为普通小麦的耐盐性较差,而小麦的许多近缘种属却具有很强的耐盐性。因此利用这些近缘种属的耐盐基因来提高小麦的耐盐性,就成为一个有效的方法。以往的研究多集中在偃麦草属(Thinopyrum)和大麦属(Hordeum),证明偃麦草是一个容易利用、耐盐性又很突出的属,利用该属植物提高小麦耐盐性的工作已取得了一些进展。而在其他种属耐盐性方面的研究还较少。本文通过对400份材料(包括普通小麦品种、小麦与黑麦杂交后代、小麦与赖草杂交后代、小偃麦后代)的芽期和苗期抗盐筛选,发现了耐盐性较强的一个稳定的小麦-黑麦二体附加系和一个稳定的小麦_黑麦1BL/1RS易位系;同时还发现了一份芽期和苗期抗性明显优于对照品种“茶淀红”的新种质98_160(小麦和延安赖草的杂交后代)。1材料和方法1.1小麦与1331.7/33.4/33.3品种资源所有权以下简称《规则》普通小麦(TriticumaestivumL.)材料中国春、BanacakaMska、“科遗26”、“希望”(Hope)、“茶淀红”;黑麦AR74以及小麦与黑麦(SecalecerealeL.)杂交后代材料98_113和98_131(80_27/AR74//BanacakaMska的后代)、98_123(系谱与98_131相同)、98_31(红蚂蚱/AR74)、98_46(新麦1号/S81245)、98_113(品加系1号);小麦与延安赖草(Leymuschinensis(Trin.)Tzvel.)杂交后代材料98_160(延小赖TM413)、98_161(延小赖TM417)、98_163(延小赖/纽根恩斯//TP114)等,共计400份(表2),均由中国农业科学院作物品种资源研究所特种室和抗逆室选育或保存。1B/1R易位系材料如洛夫林10、洛夫林13、山前2号、阿夫乐尔等由本所保存,中梁15、中梁88469及八倍体小黑麦加非13由甘肃省天水地区农业科学研究所宋建荣先生提供。1.2耐盐性能的确定和筛选1.2.1盐害指数及盐害速率在培养皿中铺垫一层滤纸,加入一定浓度的NaCl溶液(1.8%～2.0%)进行处理,并以蒸馏水处理作为对照,于20℃培养箱中发芽,其间及时补充盐水。3d后调查发芽势,7d后调查发芽率(以芽长超过种子长度1/2者为发芽标准)。计算相对盐害指数,依据盐害指数对耐盐性评级。盐害指数按下列公式计算:0～20.0%为1级,20.1%～40.0%为2级,40.1%～60.0%为3级,60.1%～80.0%为4级,80.1%～100.0%为5级。盐害指数随材料对盐的敏感性增加而增大。盐害指数(%)=对照发芽率−处理发芽率对照发芽率×100%(%)=对照发芽率-处理发芽率对照发芽率×100%1.2.2抗性水平的测定为了对每一个体的苗期抗性作出准确判断,同时便于DNA的提取和分析,我们建立了一套新的水培鉴定体系。将种子用蒸馏水浸泡,25℃培养,萌动发芽后,置于泡沫塑料板上,在Hoagland培养液中培养。在分蘖初期选取苗高和根长基本一致的材料,测量根的平均长度、苗高,调查根量,然后剪掉所有的老根和新根;在培养液中加入一定量的盐,3d更换一次溶液,逐渐提高盐浓度,同时调查单株平均根长、株高、根量、分蘖数以及叶片盐害症状,对抗性水平作出判断(标准见表1)。盐水处理30d后,换正常Hoagland培养液培养,以缓解盐害症状。1.3dna制备根尖用冰水处理24h后,卡诺固定液固定2～3d。用45%的醋酸压片,液氮冷冻揭片。载玻片气干后待用。基因组DNA经纯化后用DIG_NickTranslationMix(BoehringerMannheim)标记。封阻DNA使用前在沸水浴中煮40～50min。杂交前,载片用RNaseA(100ng/mL)37℃处理1h,2×SSC中漂洗3×5min,70%、85%、95%、100%酒精逐级脱水。配制杂交液(100%甲酰胺,20μL;50%DS,8μL;20×SSC,4μL;10%SDS,1μL;ssDNA,1μL;探针DNA150ng;50×封阻DNA/片),80℃变性后加到载玻片上。75℃变性5min,逐级降温至37℃保温过夜。杂交完成后,揭掉塑料盖片,在42℃的2×SSC中洗5min;20%甲酰胺42℃洗2次,每次5min;2×SSC,3×5min;然后在室温下,2×SSC洗3×5min,5×SSC,0.2%Tween20,洗5min。每张载片加100μL5%BSA溶液,37℃温育5min;甩干BSA,加50μLAnti-DIG-FITC,37℃恒温1h。再在37℃下用4×SSC,0.1%Tween20洗3次,每次8min,最后用抗褪色剂封片。OLYMPUSBX60荧光显微镜检测,Fuji400彩色胶片摄影。1.4ssr反应体系及引物筛选为了对98_160的耐盐胁迫基因进行染色体定位分析,对(98_160×BanacakaMska)F2群体基因水培抗盐鉴定,在F2中随机选取10株最耐盐单株和10个最敏感株DNA等量混合,分别形成DNA抗性池(PR)和DNA敏感池(PS),用以筛选与耐盐基因连锁的分子标记。初步找到标记后,再在整个F2群体中进行检验。SSR反应参照R⌀der实验室的反应体系,小麦微卫星引物由Operon公司合成(WMS编号),另外部分引物(XPSP编号)由英国JohnInnesCentre提供。PCR反应体系和反应程序见R⌀der等。扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶中电泳后,银染显色分析。用JoinMap1.4作图软件进行抗盐基因和标记位点的遗传连锁分析,并根据已知的分子连锁图确定标记位点的排列顺序。1.5种子醇溶蛋白与谷蛋白电泳分析基本采用张学勇等的方法,略作修改,丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺均改用进口试剂(BIOMOL),凝胶浓度从12%降为10%。2结果和分析2.1小麦和黑麦的盐胁迫试验材料在1.8%～2.0%的NaCl溶液中发芽,筛选出耐盐级别为1、2级的品系,结果见表2。在耐盐性较好的材料中,有11份材料耐盐性比较突出,在2.0%的NaCl溶液中,芽期盐害指数小于5%(图1A和1B),其中包括:普通小麦材料“红蚂蚱”、“希望”、“科遗26”;小麦与黑麦的杂交后代材料98_31、98_46、98_113、98_123和98_131;小麦与延安赖草杂交后代材料98_160、98_161和98_163。图1A为芽期盐胁迫15d后的表现。可以看出98_160的耐盐性很强,芽期鉴定时,在盐胁迫第7天,其表现与其他耐盐品种相似,但持续胁迫到第15天时,产生了较明显的区别,98_160的芽和根长均比其他耐盐品种长,可与目前公认的耐盐品种“科遗26”相比,明显超过耐盐对照品种“茶淀红”。同时,它在盐池鉴定中也有突出的表现(图1D)。2.2细胞学由于上述具突出抗盐特性材料中,部分为远缘杂交后代材料,可能含有外源染色体或其片段,我们对其进行了细胞学鉴定,结果如下。2.2.1以黑麦为原料的抗盐能力检测,描述工艺上的指导思想,描述工艺上的,为盐胁迫处理的依据以下简称“实行抗盐”基(1)98_113是一个稳定的二体附加系。(2)98_131染色体数已稳定在2n=42。同时发现在42条染色体中,只有1对携带随体的染色体(6B)。(3)98_31是一个八倍体小黑麦材料,2n=56;98_46为一个次级六倍体小黑麦(八倍体小黑麦×六倍体小黑麦后代),2n=42。为了更准确、直观地鉴定导入普通小麦的黑麦染色体,对98_113、98_131进行了GISH分析。用普通小麦中国春DNA作封阻,以黑麦DNA作探针进行杂交。可以看出98_113中附加了一对黑麦染色体(图1F),98_131含有一对1BL/1RS易位染色体(图1E)。为了明确黑麦1R染色体与抗盐的关系,我们对已知的1B/1R易位系洛夫林10、洛夫林13、山前2号、中梁15、中梁88469、高加索、阿夫乐尔、加非13等用2.0%的NaCl溶液进行盐胁迫处理,有6份材料对胁迫具明显耐性,其中耐盐级别为1级的有中梁15、中梁88469、高加索、加非13;耐盐级别为2级的有洛夫林10、山前2号。同时,利用种子醇溶蛋白A_PAGE分析及低分子量谷蛋白的SDS_PAGE分析,对1B/1R的真实性进行了验证,证实98_131确为1BL/1RS易位系(图2),初步推断1RS与耐盐性具有一定的相关性。2.2.2dna探针回复突变分析98_160与98_161是两个遗传来源相同的材料,均为普通小麦与延安赖草杂交的后代。但98_161染色体数大多为2n=49,而98_160染色体数却基本稳定在2n=42,尚不知其确切原因,需进一步分析其遗传背景。用延安赖草DNA作探针,对上述材料进行染色体原位杂交分析,未观察到任何典型的外源遗传物质杂交信号,而这些材料外部形态,特别是穗部明显有别于正常普通小麦。由于该远缘杂交工作于20世纪70年代完成,未能找到原用亲本延安赖草的居群,需做进一步研究鉴定。2.398.160抗弯剂和sr标记2.3.1耐盐分级和耐盐性能对98_160×BanacakaMska的F2代分离群体进行水培耐盐鉴定,结果见表3。亲本延小赖的耐盐级别为1级,BanacakaMska的耐盐级别为5级(图1C)。F2群体中抗性发生明显分离。对鉴定结果进行χ2测验,若将1、2、3级归为对盐胁迫表现抗性,将4、5级归为敏感,χ2=0.57<χ20.05‚10.05‚12=3.84,说明符合3∶1的分离比;若将1级归为耐盐,2、3级归为中间型,4、5级归为敏感,χ2=2.92<χ20.05‚10.05‚12=3.84,基本符合1∶2∶1的分离比。说明98_160的抗性可能受一对主效基因控制。2.3.298.160抗sr标记(1)ssr引物的筛选在耐盐级别为1级和5级的单株中,分别随机选取10株,将其DNA等量混合,构建成耐盐池和敏感池。随机选取分布在小麦21条染色体上的207对SSR引物对耐盐亲本、敏感亲本、耐盐池、敏感池进行PCR扩增,有56对引物在亲本间扩增出有多态性的微卫星DNA,多态性指数为27.1%。其中WMS67在耐盐亲本、敏感亲本、耐盐池以及敏感池中扩增出长短不同的微卫星DNA,在耐盐池中出现双亲的扩增带,而在敏感池中仅出现敏感亲本的扩增带,扩增带的分子量大小为90bp左右,初步认为WMS67与耐盐基因有连锁。(2)ssr标记图谱分析将WMS67在102株F2群体中进行扩增,发现绝大部分耐盐株携带耐盐亲本的特异带,而大部分敏感单株携带敏感亲本的特异带,而没有耐盐亲本的特异带(图3)。表明WMS67与耐盐基因存在连锁关系。根据已构建的小麦SSR连锁图谱可知,WMS67位于5B染色体的长臂上。对5B染色体上的其他16对SSR引物(WMS66、WMS68、WMS159、WMS191、WMS213、WMS234、WMS335、WMS371、WMS408、WMS443、WMS499、WMS540、WMS544、WMS554、WMS604、WMS639)进行筛选,其中有6对引物的扩增产物在亲本间具多态性(WMS159、WMS191、WMS213、WMS540、WMS544、WMS639)。根据SSR标记图谱,对距离WMS67较近的多态性位点(WMS213、WMS540)进行扩增。用WMS213、WMS540分别对F2群体102个单株进行SSR分析,发现耐盐级别为1、2、3级的单株的扩增产物多与延小赖的扩增带型相同或为杂合带型,耐盐级别为4、5级的单株的扩增产物多与BanacakaMska的扩增带型相同。在统计分析时,将耐盐级别为1、2、3级的归为抗性单株,4、5级的归为敏感单株。用JoinMap1.4软件进行连锁分析,微卫星标记与耐盐基因遗传距离为:WMS67与耐盐基因的遗传距离为13.9centMorgan(cM),WMS213与耐盐基因间的遗传距离为31.0cM,WMS540与耐盐基因间的遗传距离为55.4cM。耐盐基因与微卫星标记WMS67、WMS213、WMS540在5B染色体上的相对位置如图4。3耐盐性及染色体基因型的初步鉴定黑麦是小麦改良中利用最为成功的近缘种之一,其对旱、寒、热、酸、碱等逆境均具有很好的抗性,对小麦的许多病害如锈病、白粉病等有突出的抗性表现。我国自20世纪70年代初由国外引