微小rna在乳腺癌及乳腺良性病变组织中的表达及意义

微小rna在乳腺癌及乳腺良性病变组织中的表达及意义

小叶钠（mirna）是一个由内源性非蛋白质组成的内源性钠，长约22个氨基酸。miRNA通过直接剪切靶mRNA,或者通过完全/不完全与靶mRNA3′末端互补结合,抑制靶mRNA的翻译,从而参与生命过程中一系列的重要进程,甚至肿瘤发生。最近多项研究发现,若干miRNA在各种肿瘤组织中的表达水平有不同程度上调或下调,已成为当前众多科学家关注的热点之一。该领域的研究才刚刚起步,新的发现与观点却层出不穷。miR-145定位于染色体5q32-33,目前尚未发现miR-145明确的靶基因。既往研究结果均由miRNA芯片的方法得出,本研究选择组织芯片为平台,用原位分子杂交的方法检测人乳腺癌与乳腺良性病变miR-145表达,并分析其与患者临床病理特征之间关系,探讨其生物学意义。1材料和方法1.1乳腺癌病例选择收集安徽医科大学第一附属医院病理科2001年4月～2006年4月乳腺病变病理资料较齐全的石蜡标本129例,其中乳腺癌91例,患者均为女性,年龄14～60岁(中位年龄41岁);乳腺良性病变38例(包括21例纤维腺瘤,17例乳腺腺病)。所有患者术前未做化疗、免疫或放射等抗肿瘤治疗。按WHO(2003年)乳腺肿瘤分类标准对乳腺癌病例进行病理学分型。所有标本均常规10%福尔马林固定,石蜡包埋,4μm厚切片。1.2探针1.4.3原位杂交检测试剂盒MK1030和寡核甘酸探针稀释液购自武汉博士德公司;miR-145地高辛标记探针来源于美国UTM.D.AndesonCancerCenter的徐晓春博士实验室,探针序列5′-AAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACAAGGGATTCCTGGGA-AAACTGGACAAGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC-3′;DEPC由美国Sigma公司生产;DAB显色试剂盒购自北京中杉公司。1.3样本选取方法复查HE染色切片,用定位器对代表性组织位点进行标记,每例样本选3个位点;使用HT-1组织芯片制备仪(辽宁恒泰),制作核心1mm为组织芯片;4μm厚连续切片,分别作HE染色和miR-145原位杂交检测。1.4抗地高辛抗体dab操作按试剂盒说明进行。简要步骤如下:切片中滴加地高辛标记的miRNA探针(1∶400),42℃恒温杂交16h,生物素化鼠抗地高辛抗体37℃温浴60min,SABC孵育后DAB显色。用已知的阳性切片作阳性对照,用探针稀释液替代探针作阴性对照。1.5染色强度分级标准miR-145以乳腺腺上皮或癌细胞胞质中出现明显的黄色或棕黄色颗粒为阳性染色,采用半定量积分法判断结果。染色强度分级:1分,无染色或弱染色;2分,中等强度染色;3分,强染色。阳性细胞数分级:1分,阳性细胞数<10%;2分,阳性细胞数10%～50%;3分,阳性细胞数>50%。以上两项分数相乘所得的积为得分,得1～3分者为弱阳性,>3分为强阳性。强阳性为高表达。1.6统计方法采用SPSS13.0软件进行统计学处理。采用χ2检验或四格表确切概率法。2结果2.1mir-赋予的表达分布miR-145阳性信号主要定位于乳腺腺上皮或癌细胞胞质中,部分也可见间质细胞胞质着色。miR-145在乳腺腺病和纤维腺瘤病变组织中呈弥漫性分布,其高表达率为60.5%,小管和导管腺上皮细胞中多呈强表达,肌上皮也有所表达(图1);在乳腺癌组织中(图2),miR-145阳性细胞呈散在分布,阳性表达弱,高表达率为31.9%。两者差异具有显著性(P<0.05)。2.2mir-赋予多态性分布的表达乳腺癌miR-145表达与患者临床病理特征的关系(表1)。miR-145的高表达率随腋淋巴结受累及其受累数目的增多而升高,差异有显著性(P<0.01)。随临床分期的增高,miR-145高表达率有升高的趋势(P<0.05)。c-erbB-2高表达,miR-145高表达率亦高(P<0.01)。随着组织学分级的升高,miR-145高表达率也有一定的升高的趋势,但各组间差异无显著性(P>0.05)。3mir-赋予患者成熟障碍miRNA是一类内源性非蛋白质编码的RNA分子,广泛分布在病毒、植物到高等哺乳动物中。多数的miRNA具有高度保守性、时序性、组织细胞特异性,受到发育和空间的调控,并参与细胞的分化、增殖、死亡。目前,miRNA已知的功能是在转录后水平调控基因的表达,主要作为基因表达的负调控因子。大量研究证明,miRNA与多种肿瘤的存在密切相关,它的作用靶点可为抑癌基因,定位于扩增区,使其表达上调,则发挥抑癌基因样作用;其靶点也可为癌基因,当癌基因mRNA表达水平升高时,miRNA则发挥阻止细胞的恶性转化的作用。研究表明,在结肠直肠肿瘤中,成熟miR-145水平显著下降,但在正常组织和肿瘤中检测到这些miRNAs的发夹结构前体转录体的数目差别不大,表明miR-145在肿瘤形成过程中存在成熟障碍。目前的研究显示miR-145在乳腺癌、结肠癌和淋巴瘤细胞中表达都是下调的。本研究通过原位分子杂交的方法,检测91例人乳腺癌与38例乳腺良性病变miR-145表达,而Iorio等利用基因芯片技术对乳腺癌中的多种miRNA进行了研究,我们的结果与他们的一致,即:miR-145在乳腺癌组织中低表达。然而,他们并没有明确miR-145与乳腺癌病理特征之间的关系。本研究发现miR-145与淋巴结转移、TNM分期及c-erbB-2表达呈显著性相关。这些特征都与肿瘤的发展以及不良生物学行为密切相关,其中淋巴结转移和c-erbB-2更是患者预后不良的重要标志,提示乳腺癌组织中miR-145的高表达可能预示患者的不良预后。在本研究中,乳腺癌组和乳腺良性病变组的年龄分布经χ2检验,差异有显著性(P<0.01),乳腺良性病变组的平均年龄(39.7岁)小于乳腺癌组(50.0岁),不能排除年龄对miR-145表达的影响。虽然认为多数miRNA具有时序性,但miR-145表达量有可能随着年龄的增长而逐渐降低有待进一步证实,同时,由于miR-145充当了抑癌基因的角色,那么miR-145时序性表达下降是否是造成了乳腺癌的发病率增高原因之一呢?这引起了我们的兴趣,将在下一步的实验中进一步探讨。目前尚未发现miR-145明确的靶基因,潜在靶序列可能有:参与信号传导途径的基因、参与基因表达的染色质调控基因、参与蛋白质转录和代谢过程的基因及参与RNAs和蛋白质加工处理的基因等均可能为miR-145的潜在靶基因。Shi等发现miR-145通过作用胰岛素受体底物-1来抑制结肠癌细胞的生长,我们的结果显示miR-145与c-erbB-2表达呈正相关,而癌基因c-erbB-2与乳腺癌的发生、发展又有着密切的关系,那么miR-145是否与癌基因c-erbB-2