植物组织培养

植物组织培养项目三培养基配制技术教学终极目标会配制MS固体培养基能按照培养基配方熟练进行化学药品称量和试剂配制会使用高压灭菌锅灭菌会阐述培养基配方成分在组培中的作用促成目标教学目标

培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素。按所用原料不同，可分为两类：应用肉汤、马铃薯汁等天然成分配制的，称为天然培养基；应用化学药品配成并标明成分的，称为合成培养基或综合培养基。

项目介绍工作任务

配制MS培养基母液。

任务1配制MS固体培养基并灭菌。

任务2任务一MS培养基母液配制母液：将所用培养基配方的化学成分按一定的比例配成浓缩液。一、母液种类

营养元素母液大量元素母液微量元素母液铁盐母液激素母液1、大量元素

原则上可以混在一起，但硫酸镁与氯化钙要单独配制，因为高浓度的Ca2+与Mg2+与磷酸盐混合，会产生不溶性沉淀。配制方法：用天平称取药品，分别加入600-700ml蒸馏水中，再用磁力搅拌器搅拌，待第一种药品溶解，加入第二种药品，最后定溶。或每一种药品分别溶解，然后混合，最后定溶。二、母液的配制2、微量元素用分析天平准确称取药品，分别溶解，依次混合，最后定溶。有时KI单独配制。

3、铁盐母液易沉淀，需单独配制，一般配成硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）与乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)的铁盐螯合剂。用少量蒸馏水将Na2-EDTA加热溶解后，再缓缓倒入FeSO4溶液充分搅拌并加热5分钟，使其充分螯合。

4、有机物母液分别称取药品，溶解，混合后加水定容。5、激素母液必需单独配制，储存于冰箱。一般浓度为0.5-1mg/ml。

IAA、NAA、IBA、2，4-D等，可先用0.1mol/L的NaOH或95%的酒精溶解，然后定溶。

KT、BA等细胞分裂素应先溶于少量0.1mol/L的HCl，然后定溶。母液名称药品名称

原配方量(mg)/L扩大倍数

称取量(mg)母液体积(ml)

移取量ml/L大量元素母液

NH4NO3165010165001000100KNO319001019000CaCl·2H2O440104400MgSO4·7H2O370103700KH2PO4170101700微量元素母液MnSO4·H2O22.31002230100010ZnSO4·7H2O8.6100860CoCl·6H2O0.0251002.5CuSO4·5H2O0.0210025H3BO36.2100620Na2MO4·2H2O0.2510025KI0.8310083铁盐母液FeSO4·7H2O28.71002870100010Na2-EDTA37.31003730有机物母液烟酸(Vpp)0.5502550010盐酸吡哆醇0.55025盐酸硫胺素0.1505肌醇100505000甘氨酸250100ＭＳ培养基母液的配制组成MSB5（改良）N6

mg/Lg/10.Lmg/Lg/10.Lmg/Lg/10.LNH4NO3165016.5

KNO3190019.0250025.0283028.3CaCl2•2H2O4404.41501.51661.66MgSO4•7H2O3703.72502.51851.85KH2PO41701.7

4004.00(NH4)2SO4

1501.54634.63NaH2PO4•H2O

1501.5

或NaH2PO4•2H2O

1681.68

（1）大量元素母液（10X）：

称10升量溶解在1升水中。配1升培养基取100ml。（2）微量元素母液（100X）：

称10升量溶解在100ml水中。配1升培养基取10ml组成MSB5（改良）N6

mg/Lmg/10.Lmg/Lmg/10.Lmg/Lmg/10.LH3BO36.2623301.616MnSO4•H2O21.4214101004.242ZnSO4•7H2O8.6862201.515Na2MoO4•2H2O0.252.50.252.5

CuSO4•5H2O0.0250.250.252.5

CoCl2•6H2O0.0250.250.252.5KI0.838.30.757.5

（3）铁盐母液（100X）：

称10升量溶解在100ml水中。配1升培养基取10ml。组成MS或

B5（改良）mg/Lmg/10.LNa2•EDTA37.3373FeSO4•7H2O27.8278

将上述两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中EDTA（乙二胺四乙酸二钠）较难溶解完全，急需时可适量加热，当两者均充分溶解完全后，先取一种置容量瓶中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液为好，最后定容。（4）维生素母液（100X）：

称10升量溶解在100ml水中。配1升培养基取10ml组成

MSB5（改良）

N6

mg/Lg/10.Lmg/Lg/10.Lmg/Lg/10.L肌醇10010001001000烟酸0.55110盐酸吡哆（VB6）0.55110盐酸硫胺素（VB1）0.4410100甘氨酸220

配制倍数不宜过高，可避免浪费；也可避免倍数过高，吸取量相对少而影响准确性。母液配制好后应放在2～4℃冰箱内保存。母液贮备时间不宜过长。过长时宜出现沉淀和微生物污染。配制母液注意几点：一、MS培养基的配制配制方法：1、将母液按顺序摆放2、取适量的蒸馏水(所需培养基量的2/3)入容器3、按需要量依次取母液（吸取量=配制浓度×体积/母液浓度）及生长调节物质4、加入蔗糖(30g/L)溶解5、加琼脂(6-10g/L)，煮沸，2-3min6、定容7、调PH值(pH=5.8)8、分装培养瓶，封口9、高压灭菌任务二、MS培养基的配制与灭菌糖适量水母液①③②④⑤⑥⑦湿热灭菌辐射灭菌过滤灭菌琼脂

加热溶解

定容调pH值

分装

灭菌配制流程二、培养基的灭菌湿热灭菌法

培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌的原理：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在108kPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。过滤灭（除）菌（不耐热的物质）

一些生长调节剂(赤霉素、玉米素)、某些维生素是不耐热的，常用过滤灭菌-细菌过滤器方法。防细菌滤膜网孔的直径为0.45μm以下，可阻止细菌细胞和真菌的孢子通过。一、配制MS培养基母液二、配制MS固体培养基并灭菌实践操作一、培养基成分：1、无机营养：大量元素微量元素铁盐2、有机营养成分：有机附加物氨基酸维生素肌醇糖类3、植物生长调节物质：生长素细胞分裂素等问题探究4、琼脂5、活性炭6、pH7、水椰乳（CM）8、天然物质：酵母提取物（ME）麦芽提取物（YE）

1)大量元素：指浓度大于0.5mmol／L的元素。

[C、H、O、N、P、K、Mg、S和Ca]。2)微量元素：指小于0.5mmol／L的元素。铁（Fe）、铜（Cu）、锌（Zn）、锰（Mn）、钼（Mo）、硼（B）、碘（I）、钴（Co）、氯（Cl）、钠（Na）等

两类元素虽然在培养基中含量差距很大，但都是不可少的营养成份。含量不足就造成缺素症。

大量元素占植物体干重的百分之几十至万分之几的分量。

N分硝态氮（NO3-）和铵态氮（NH4+），不同离体组织所需的含量不一致，单独使用易导致培养基酸碱性漂移两者要保持适当比例。Fe：易形成絮状沉淀，常以Fe·EDTA的形式提供。FeSO4·7H2O＋Na2·EDTA1、无机营养元素(inorganicelement)

最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，麦芽糖、半乳糖、甘露糖也有所应用。使用浓度在1%—5%，常用3%

在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。

（1）碳水化合物糖类作用：在组织培养中用作离体组织生长的碳源，维持培养基一定的渗透压。培养效果有差异：葡萄糖＞果糖=蔗糖＞麦芽糖2、有机化合物(organiccompound)

在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动对离体组织的生长具有明显的促进作用，主要为B族维生素。种类：VBl(盐酸硫胺素)、VB3（泛酸）、

VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)Vc（抗坏血酸）、VH(生物素)VB11(叶酸)、VB12（钴胺素)等。使用浓度：一般用量为0.1-1.0mg／L。（2）维生素(vitamin)

。Vc具有很强的还原能力，常用于防止组织褐变。

又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。使用浓度：一般为lOOmg／L。作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。（3）肌醇

作用：蛋白质的组成部分，也是一种有机氮化合物。是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等半胱氨酸及多种氨基酸的混合物（水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。使用浓度：为10-200mg／L。（4）氨基酸(alminoacide）

当有机氮为唯一氮源时，离体组织生长不良，只有在无机氮存在的条件下，才能取得理想的效果，它的主要作用是促进细胞生长。如：酪蛋白水解物和胰蛋白水解产生的胨能增进国兰类组织的生长，300mg/L谷氨酰胺也能起到同样的作用，精氨酸对卡特兰、万代兰未成熟的种子有刺激其生长的作用天门冬酰胺有促进国兰类籽苗生长的作用3、有机附加物（天然复合物）

成分不固定，主要有效成份大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。作用：它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。

如:在组织培养蝴蝶兰时，常加入香蕉泥或椰乳，可明显促进原球茎发育成完整植株并加速小苗的生长。150-200ml／L10%—20%150—200g／L0.01%-0.05%0.01%-0.5%浓度

植物生长调节物质是一些对植物生长发育及生理活动有特殊作用的生理活性物质。这类物质极少量存在就对植物生命活动起到调节作用，有些可以刺激植物生长，而有些抑制植物生长。在组织培养中，植物生长调节物质对愈伤组织的诱导、器官分化的植株再生具有重要的作用。4、植物生长调节物质(hormone)

赤霉素（gibberellicacid）细胞分裂素类(cytokinin)生长素类(auxin)主要包括：

组培中的作用：主要被用于诱导愈伤组织形成，促进细胞伸长生长和促进生根。

（1）生长素类

概念：指能引起完整组织中的细胞扩展的化合物，主要生理作用是促进细胞的纵向伸长，生长素包括内源的（存在于植物体内的）和人工合成的。用量：mg/L级，mg/L=ppm用法：溶于95％乙醇或0.1mol/LNaOH

既促进生长，又能抑制生长、甚至杀死植物；既促进发芽，又会抑制发芽；既能防止落花落果，又可疏花疏果。这取决于浓度、细胞的年龄和器官的种类。一般低浓度促进生长，中浓度抑制生长，高浓度则杀死植物。在细胞年龄上幼年细胞比成熟细胞敏感。生长素的作用具有两重性：农业生产中的作用：插枝生根防止器官脱落诱导菠萝开花促进果实形成

组培中的作用：诱导愈伤组织的产生，促进细胞脱分化组织培养促进细胞伸长促进生根生长素的应用在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，(10-5-10-8mg/L)就可促进生长，其次是茎和芽。

吲哚乙酸：IAA（indoaceticacid）萘乙酸：NAA（naphthaleneaceticacid）吲哚丁酸：IBA（indolebutyriacid）

2,4-二氯苯氧乙酸：2,4—D(2,4-dichlorophenoxybutyricacid)

另外：吲哚丙酸(IPA)、萘氧乙酸(NOA)等

生长素种类：NAA、IBA→生根培养2,4-D→愈伤组织诱导与增殖IAA(吲哚乙酸)NAA(萘乙酸)IBA(吲哚丁酸)2,4—D(2,4—二氯苯氧乙酸)生长素作用强弱顺序：强弱（2）细胞分裂素类细胞分裂素作用：①促进细胞分裂与扩大。②诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长。③抑制根的分化。用量：mg/L级用法：溶于0.5mol/L稀HCl或稀NaOH，通常多用

NaOH助溶。概念：是一类具有促进细胞分裂和其他生理功能的物质总称。都为腺嘌呤的衍生物。在高等植物中普遍存在，特别是茎尖、根尖、未成熟的种子和生长着的果实等进行着细胞分裂的器官。生理作用和应用：1）促进细胞分裂和扩大在组织培养中，当培养基缺少细胞分裂素时，细胞很少分裂、生长，加入细胞分裂素后，细胞就进行分裂，组织增大，产生愈伤组织。细胞分裂素可以使细胞横向扩大而不是伸长。在生产中可以对绿肥、叶用蔬菜等叶用作物施用一些细胞分裂素，能够增产。2）延迟衰老和保鲜

作用原理：阻止核酸酶和蛋白酶等水解酶的产生；阻止营养物质向外流动并使其向细胞分裂素所在的部位运输，促进物质的积累。在生产上可以用于防止贮藏蔬菜的变质，延长贮藏时间。3）诱导芽的分化在愈伤组织的分化培养中，产生根或芽，取决于生长素与细胞分裂素浓度的比值。例如，在烟草愈伤组织培养时，当激动素：生长素为0.02：2mg/L时，能诱导根的分化；两者比值为0.2：2mg/L时，愈伤组织只生长不分化；当激动素的比例提高到0.5：2mg/L时，能诱导芽的分化。4）其他促进侧芽发育，防止果树生理落果，可打破种子的休眠，促使其发芽。常用种类：

6-BA(6-苄基腺嘌呤)Kt(kinetin激动素)Zt(zeatin玉米素)Kt(激动素)6-BA(6-苄基腺嘌呤)Zt(玉米素)细胞分裂素作用强弱顺序强弱（3）赤霉素用量：mg/L级用法：易溶于水、乙醇，多用95％乙醇溶解储存。GA3（赤霉素）：最初从赤霉菌中提取到，能够引起水稻等植株徒长。在组织培养中有时使用，如用于匍匐茎的诱导。作用：通过调节生长素的含量实现促进细胞伸长的。促进幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小植株打破休眠。多用GA3。赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响：当生长素/赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。

脱落酸（ABA）→因物种不同，能促进或抑制愈伤组织生长；乙烯（Eth）→有催熟作用，大量积累易影响生长、分化，导致培养物早衰、落叶和玻璃化苗，应尽量排除之；（BR）→可能与CYT有类似作用，有待研究。另外：紫罗兰组织培养

选择适合植株增殖的生长培养基，外植体表面长满绿色幼苗和并长出很多小根。Nosucrose(0%)Sucroseto1%Sucroseto5%外植体发生很少的幼苗，不产生根和愈伤组织外植体表面产生幼苗，并产生少量的根。外植体表面产生很多幼苗，同时幼苗基部产出很多根，原因是培养基中加入适合的控制物质。糖对紫罗兰组培的影响NoBA

BAreducedto0.1mg.l-1

A：BA(0mg/L)，芽（减少），根（增多）愈伤组织（定量）B：BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（定量）细胞分裂素-BA对紫罗兰组培的影响6、抗生物质(antibiotic)

种类：青霉素、链霉素、利福平、卡那霉素庆大霉素等。浓度：5-20mg/L。作用：可防止菌类污染，主要抑制内生菌。多数需过滤灭菌7、活性炭(activecarbon)

目的：是利用其吸附能力，减少一些有毒物质的影响。

如：用于防止酚类物质污染引起组织褐化死亡。也能使培养基变黑，有利于某些植物生根。使用浓度：1-5g/L。它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至不吸附。8、水（water)

作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。

注意：用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养基成分的精确性。配制培养基母液时要用蒸馏水，大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良果。二、培养基的PH值(pHvalue)1、多数植物要求pH5.6-5.82、常用0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L的HCl来调节。3、注意：经高压灭菌后，培养基pH会下降0.2-0.8,故调整pH值时,应高于0.5；

pH的大小会影响琼脂的凝固能力，当pH>6.0时，培养基将会变硬，pH<5.0时，琼脂凝固不好。种类最适pH值种类最适pH值杜鹃4.0月季5.8越桔4.5胡萝卜、石刁柏6.0蚕豆5.5桃7.0番茄5.7

不同植物对培养基最适pH值的要求不同(见表)培养基的选择

(一）培养基的种类（二）常用的培养基的特点（三）培养基的筛选拓展知识(一）培养基的种类培养基按试验目的分为：1、诱导培养基（脱分化培养基）：外植体诱导发生愈伤组织的培养基。水稻诱导愈伤组织时加2.4-D；而烟草、胡萝卜既需生长素，又需细胞分裂素。2、继代培养基：诱导出愈伤组织后，使愈伤组织能不断地生长下去的培养基。3、分化培养：由愈伤组织诱导形成小苗（幼芽或胚状体）的培养基。①不加任何激素的基本培养基，即可诱导分化。如水稻、珍珠粟、甘蔗等植物。②加较高浓度细胞分裂素和少量生长素培养基。如烟草、矮牵牛、四季海棠、天竺葵、菊花、倒挂金钟等组织的分化。贴梗海棠:MS+BA3+IAA0.1+NAA0.2③需要有一种或一种以上的生长素的培养基，如枸杞、苜蓿、百合、唐菖蒲等。④只加细胞分裂素的培养基。如豌豆、油菜、小麦等。4、生根培养基：

诱导再生小苗生根的培养基。在无任何生长激素的基本培养基中就可生出良好的根系。如烟草、红薯、草莓、枸杞等。有些需加入少量的NAA、IAA或IBA以诱导根。有些需要减低培养基中无机盐的浓度。如用MS培养基中1/2或1/4的无机盐诱导生根，常可获得良好的效果。

固体培养基在培养基中加入一定量的凝固剂，使液体培养基固化.

优点：使用方便，占地不大。缺点：培养外植体只能有部分组织与培养基接触，培养物上下部因接受养分不均匀，引起组织生长的差异。液体培养基培养物消毒后直接置于液体培养基中培养。优点：培养物吸收营养比较充分，容易获得均匀一致的细胞群体。缺点：转换培养基较麻烦。培养基按其物理性质划分为：（二）常用的培养基的特点MS培养基无机盐数量适宜，硝酸盐、钾和铵盐的含量比其他培养高。应用最广泛。主要用于园艺植物、木本植物、花卉、蔬菜等的组织培养。B5培养基

铵的含量较低。在豆科植物上应用最多。培养大豆细胞和组织培养设计。White培养基成分比较简单，无机盐和糖的用量低。（三）培养基的筛选1.实验前的准备工作文献检索参观咨询2.预备试验3.常用的试验方法单因子试验、多因子试验及广谱实验等。1.筛选：在多种培养基上培养，根据培养物的生长情况，确定较适宜的培养基。2.调整：根据培养物的生长情况或培养目的的不同，对培养基进行调整，探索新的培养基。如：改良MS、改良B5培养基、N6培养基等。筛选合适的培养基

——组培成功的基础考虑：一、筛选基本培养基在多种培养基上培养，根据培养物的生长情况，确定较适宜的培养基。二、调整各种激素的浓度及相对比例根据培养物的生长情况或培养目的的不同，对培养基进行调整，探索新的培养基。如：改良MS、改良B5培养基、N6培养基等。怎么选择基本培养基？

如：新的植物材料MS：大多数双子叶植物

B5和N6：许多单子叶植物，N6禾本科小麦、水稻

White适合于根的培养怎么根据实际情况来调整某些成分？1、用一种化合物作为N源时，硝酸盐的作用比氨盐好，单独使用硝酸盐会使pH向碱性方向漂移，同时加可克服。2、根据某些元素供应不足的症状。激素浓度和相对比例如何确定？（1）查阅文献（2）拟用激素选择3-5个水平，随机组合建立实验方案。

1234567891011121314151600.51.02.00.51.534.5序号

CTK/mgL-1

auxin/mgL-1两种激素4种浓度的第一次组合实验第二次激素配比实验序号

CTK/mgL-1

Auxin/mgL-1 1.01.251.51.750.250.50.75123456789101112在此基础上可进行培养基他成分的变动实验。如蔗糖、琼脂、pH、氨基酸等。培养基配方试验方法

一、单因子试验二、多因子试验三、逐步添加和逐步排除试验法四、广谱实验法一、单因子试验培养基中其他成分都维持在一般水平上，只变动一个因子，找出这一因子对试验的影响和影响的程度。例如MS基本培养基，只变动NAA用量对某一培养物生根的影响，这种只研究一个因素的试验就是单因子试验。生物学试验不同于物理学或化学试验，最显著的差别是在生物学试验中必需设置对照组与试验组。试验中要求对照组与试验组中的试验个体，即植物组织块或其他培养物，必须在遗传性、生理状态、前培养条件等方面，尽可能完全一致。以保证试验结果是来源于试验因子，而不是由于试验材料的不一致导致的。试验中各处理一般都要设有一定的重复，以取得可靠的试验结果。随试验规模和要求不同，大多每个项目要有4-10瓶，每瓶至少3块培养物或3丛小幼苗。二、多因子试验对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验。试验可采用完全试验方案，也可选用正交设计方案。1、完全试验完全试验方案具有均衡完全的特点，各个因子的每个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合。

2、正交试验完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验越复杂，消耗的精力、物力越多。为了减少试验处理，但又能准确全面地获得试验信息，通常采用正交试验。Latinsquare处理号列号123411111212223133