第五章-工业生物催化剂课件

第四章

工业生物催化剂小组成员：陈丽兰、杨欢、祁海平、叶欣、刘文虎第四章

工业生物催化剂小组成员：陈丽兰、杨欢、祁海平、叶欣、Contents4.1概述

4.2酶制剂工业

4.3工业酶制剂的应用

4.4酶制剂的改性和提高4.5工业生物催化的前景4.6参考文献

Contents4.1概述4.2酶制剂工业4.3工1.1生物催化剂的概念

生物催化剂是由生物合成的具有催化作用的物质。

现阶段工业上应用的生物催化剂包括生物体（微生物）和酶类。

微生物是最常用的活细胞催化剂,酶催化剂则是从细胞中提取出来的,只在经济合理时才被应用。1概述1.1生物催化剂的概念1概述1.2生物催化剂与化学催化剂的比较与传统的化学催化剂相比，生物催化剂具有的优点：（1）常温常压、近于中性条件下进行，因而投资少、能耗低、操作安全；（2）极高的催化效率和反应速度，比化学催化剂的催化效率高107～1013倍；（3）高度专一性（包括底物专一性和立体专一性），能有效催化一般化学催化剂难以催化的手性反应；（4）本身是微生物和蛋白质，易于生物降解，是理想的绿色催化剂缺点：（1）稳定性较差（易受热、受某些化学物质及杂菌的破坏而失活）；（2）反应时对温度和pH范围要求较高。1概述1.2生物催化剂与化学催化剂的比较1概述1.3工业生物催化剂应用现状

生物催化应用于大规模工业生产是从20世纪60年代开始的，在几十年的发展过程中，工业生物催化取得了长足的进步，利用生物技术生产的工业产品逐年增加。典型产品：1概述1.3工业生物催化剂应用现状1概述2.1酶的几种主要生产方法（1）提取法提取分离法是采用各种提取、分离、纯化技术从动植物的组织、器官、细胞或微生物细胞中将酶提取出来。酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。主要的提取方法有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。2酶制剂工业2.1酶的几种主要生产方法2酶制剂工业（1）提取法提取分离法的特点：①设备较简单；②操作较方便；③来源受到限制，不适于大规模的工业生产。（动植物的生产周期长易受地理、气候和季节等因素的影响。）20世纪50年代以后，随着发酵技术的发展，许多酶都采用生物合成法进行生产。然而，在动、植物或微生物的组织、细胞中提取所需的酶，仍然有其使用价值，至今仍然使用。例如，从动物的胰脏中提取分离胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶；从柠檬酸发酵后得到的黑曲霉菌体中提取分离果胶酶等。2.1酶的几种主要生产方法（1）提取法2.1酶的几种主要生产方法（2）生物合成法生物合成法生产用酶首先要经过筛选、诱变、细胞融合、基因重组等方法获得优良的产物工程菌。然后在生物反应器中进行细胞培养，通过细胞反应条件优化，再经过分离纯化得到人们所需的酶。利用微生物细胞的生命活动获得所需酶的方法又称为发酵法，根据细胞培养方式的不同，发酵法可以分为液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞发酵、固定化原生质体发酵等。现在普遍使用的是液体深层发酵技术。2.1酶的几种主要生产方法（2）生物合成法2.1酶的几种主要生产方法2.1酶的几种主要生产方法（2）生物合成法酶的工艺生产过程：①原料选择；②菌种选育和发酵（固体培养与液体深层培养法）；③酶制剂生产的下游工程。2.1酶的几种主要生产方法（2）生物合成法第五章-工业生物催化剂课件2.1酶的几种主要生产方法（2）生物合成法发酵制取酶制剂的优点：①种类繁多,凡是动植物体内有的酶几乎都能从微生物中找到,并可根据应用特点和要求,筛选出最佳的产酶菌株；②繁殖快,发酵周期短,培养简便,能通过控制培养条件大幅度提高酶的产量；③微生物具有较强的适应能力,可采用各种遗传变异手段,培育出新的、更理想菌株。2.1酶的几种主要生产方法（2）生物合成法（3）化学制取法

包括酶的化学全合成、酶类似物和模拟酶的化学合成。化学合成法证明了酶等的化学本质是蛋白质,也说明人们可以通过化学的方法在实验室中合成包括酶在内的各种生命物质。化学制取法和提取法一样，由于原料来源受限制,生产成本高,污染环境,难以实现工业化生产。2.1酶的几种主要生产方法（3）化学制取法2.1酶的几种主要生产方法2.2提高酶产量的措施（1）添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导β-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。诱导物一般可以分为3类：酶的作用底物酶的催化反应产物作用底物的类似物2.2提高酶产量的措施（1）添加诱导物2.2提高酶产量的措施（2）控制阻遏物的浓度据阻遏作用机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。①产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。②分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。2.2提高酶产量的措施（2）控制阻遏物的浓度2.2提高酶产量的措施（2）控制阻遏物的浓度为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。

对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源添加一定量的环腺苷酸（cAMP）2.2提高酶产量的措施（2）控制阻遏物的浓度采用其他较难利2.2提高酶产量的措施（3）添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、曲通(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如‘新洁而灭’等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。

2.2提高酶产量的措施（3）添加表面活性剂2.2提高酶产量的措施（4）添加产酶促进剂产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。在酶的发酵生产过程中，添加适宜的产酶促进剂，往往可以显著提高酶的产量。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高1～20倍,添加聚乙烯醇（Polyvinylalcohol）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。2.2提高酶产量的措施（4）添加产酶促进剂2.3酶活性测定酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活性是研究酶的特性、分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。

酶活性是用在一定条件下，它所催化某一反应的反应初速度来表示。

酶反应速度（指速初度）可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。其单位为mol/s。2.3酶活性测定酶活性，是指酶催化一定化学反应的能2.3酶活性测定酶活性的测定方法：酶活性与底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂、抑制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。酶活性测定可用终止反应法或连续反应法。终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停止，取出反应物或产物，予以分离，再确定反应物的消耗量，或产物的形成量，算出酶活性。连续反应法无需终止反应而是在酶反应过程中用光学仪器来监测反应进行情况。其中以光谱吸收的变化更为准确。2.3酶活性测定酶活性的测定方法：2.4酶的提炼（1）酶溶液的制取酶溶液制备包括三个过程的工作：①材料预处理和破碎细胞；②抽提；③抽提液的浓缩。酶蛋白的分布：胞外酶、胞内酶（溶酶、结酶）2.4酶的提炼（1）酶溶液的制取第五章-工业生物催化剂课件2.4酶的提炼（2）根据分子大小轻重建立的分离纯化方法①透析和超过滤；②离心分离；③凝胶过滤等。2.4酶的提炼（2）根据分子大小轻重建立的分离纯化方法2.4酶的提炼（3）调节溶解度的分离方法调整溶解度的分离方法是根据酶和杂蛋白质在溶解度性质上不同而建立的一些方法。①盐析法；②有机溶剂沉淀法；③共沉淀法；④选择性沉淀法等。2.4酶的提炼（3）调节溶解度的分离方法2.4酶的提炼（4）按分子电荷的正负多少设计的分离方法分子荷正电多的物质，与荷负电性的物质反应强，受负电场的影响大；荷负电性多的物质正相反。①吸附交换分离法；②电泳分离法；③聚焦层析法等。2.4酶的提炼（4）按分子电荷的正负多少设计的分离方法2.4酶的提炼（5）根据亲和作用建立的纯化方法由于酶对底物、竞争性抑制剂、捕酶等配体具有较高的亲和力，而其他杂蛋白对它们没有或有很弱的亲和作用。因此，可以根据酶、杂蛋白对配体亲和力的差异，很容易地将酶分离出来。已建立的方法有亲和层析、亲和电泳法等。2.4酶的提炼（5）根据亲和作用建立的纯化方法2.4酶的提炼（6）其他根据稳定性的差异建立的分离纯化方法：热变性法、酸碱变化法和表面变性法等。蛋白质(酶)的高效液相色谱分离分析法。2.4酶的提炼（6）其他2.5固定化酶以往使用的酶绝大多数是水溶性的酶。这些水溶性酶催化结束后，极难回收，因而阻碍了酶工业的近一步发展。60年代以后，在酶学研究领域内涌现出固定化酶。

它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上、或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用。2.5固定化酶以往使用的酶绝大多数是水溶性的酶。这2.5固定化酶（1）酶的固定化方法：①吸附法；②包埋法；③共价键结合法；④交联法。2.5固定化酶（1）酶的固定化方法：第五章-工业生物催化剂课件2.5固定化酶（2）固定化酶的性质酶活性变化：与其溶液酶相比，大多数固定化酶活性下降。（原因：酶与不溶性载体相结合引起结构发生了变化；酶活性中心的重要氨甚酸残基与载体相结合。）稳定性变化：大多数酶在固定化后都不同程度地提高了稳定性，延长了有效寿命。（原因：固定化增加了酶构象的牢固程度。挡住了不利因素对酶的侵袭。限制了酶分子间的相互作用。但是，如果固定化触及到酶活性敏感区域，也可能导致酶稳定性下降。）最适pH的变化最适温度的变化动力学常数的变化2.5固定化酶（2）固定化酶的性质2.6固定化酶反应器（1）固定化酶反应器的类型①间歇式酶反应器（BatchReactor，BSTR）底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完成后，固定化酶用过滤或超滤法回收，再转入下一批反应。优点：装置较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能迅速达到稳态。缺点：操作麻烦，酶经多次反复回收使用后易失去活性，工业上很少用于固定化酶，常用于游离酶。2.6固定化酶反应器（1）固定化酶反应器的类型2.6固定化酶反应器②连续搅拌釜式反应器（ContinuousStirredTandReactor，CSTR）向反应器投入团定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流人底物溶液，同时，以相同流速输出反应液(含产物)。优点：在理想状况下，混合良好，各部位组成相同，并与输出成分一致。缺点：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损问定化酶颗粒。2.6固定化酶反应器②连续搅拌釜式反应器（Continuo2.6固定化酶反应器③填充床反应器（PackedBedReactor，PBR）将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后通入底物溶液，在一定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液(含产物)。优点：高效率、易操作、结构简单等，因而是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。缺点：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶液含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBR。④其他流化床反应器（FluidizedBedReactor，FBR）；连续搅拌罐-超滤膜反应器（CSTR-UFR）等。2.6固定化酶反应器③填充床反应器（PackedBed2.6固定化酶反应器（2）固定化酶反应器的选择影响酶反应器选择的因素很多．但一般从以下几个方面考虑：固定化酶的形状；底物的物理性质；酶反应动力学特性；酶的稳定性；操作要求及反应器本身的代价等。2.6固定化酶反应器（2）固定化酶反应器的选择3工业酶制剂的应用3.11,3-丙二醇1,3-丙二醇（1,3-propanediol，PDO）是一种重要的化工原料，由PDO合成的聚酯如聚对苯二甲酸二醇酯（PTT）等具有良好的性能和广阔的工业化前景。

主要用途：①作为产品中的组分提高产品性能，如化妆品、抗冻剂等；②作为医药和有机合成的中间体用于食品、化妆品和制药等行业，如合成增塑剂、防腐剂、乳化剂、香味增强剂等；③作为单体用于合成聚酯和聚氨酯，是PDO最重要的用途。3工业酶制剂的应用3.11,3-丙二醇3工业酶制剂的应用（1）1,3-丙二醇的化学合成方法PDO有多种合成方法，主要由环氧乙烷羰基化法和丙烯醛水解法。①环氧乙烷（EO）羰基化法EO+CO+2H2→PDO

反应压力大，装置投资较大。

②丙烯醛水解法CH2=CHCHO+H20→HOCH2CH2CHOHOCH2CH2CHO+H2→HOCH2CH2CH2OH丙烯醛本身也是一种重要的有机中间体，且属剧毒、易燃、易爆物品，难以储存和运输。3工业酶制剂的应用（1）1,3-丙二醇的化学合成方法3工业酶制剂的应用（2）1,3-丙二醇的发酵法以葡萄糖为底物经由甘油生产，技术中使用克隆了肺炎克雷伯菌中的dha调节因子的大肠杆菌（基因工程菌）。由甘油到PDO反应的过程中，一部分底物甘油通过还原途径，经甘油脱水酶和PDO氧化还原酶催化，得到PDO；另一部分甘油通过氧化途径供菌体生长需要，并提供还原所需的NADH2。催化过程需要与菌体生长耦合在一起的多个酶协调作用，并且菌体在具有生物活性的时候，才能保证足够的还原当量和一些辅酶的再生，最终保证催化反应的顺利进行。3工业酶制剂的应用（2）1,3-丙二醇的发酵法第五章-工业生物催化剂课件3工业酶制剂的应用3.2L-异亮氨酸异亮氨酸(2-amino-3-methylvalericacid)由Ehrlich于1904年首次从甜菜糖浆中分离出来,其化学组成虽与亮氨酸相同,但理化性质各异,故命名为异亮氨酸。

异亮氨酸有4种光学异构体,自然界中存在的仅为L-异亮氨酸。作为人体必需的8种氨基酸之一,成年人每天需要从外界摄取20mg/kg(体重)的L-异亮氨酸。L-异亮氨酸是合成人体激素、酶类的原料,具有促进蛋白质合成和抑制其分解的效果,在人体生命活动中起着重要作用,因此,在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。3工业酶制剂的应用3.2L-异亮氨酸3工业酶制剂的应用（1）L-异亮氨酸的生产方法L-异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法、发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制,生产成本高,污染环境,难以实现工业化生产。微生物发酵法生产L-异亮氨酸具有原料成本低,反应条件温和,容易实现大规模生产等优点,是目前生产L-异亮氨酸最主要的方法。

L-异亮氨酸发酵有添加前体发酵（又称微生物转化法）和直接发酵-种方法。3工业酶制剂的应用（1）L-异亮氨酸的生产方法3工业酶制剂的应用（2）L-异亮氨酸的生物合成途径以葡萄糖为原料生物合成L-异亮氨酸涉及到EMP、HMP、TCA、乙醛酸循环、伍德沃克曼反应,以及苏氨酸合成水平和分支链氨基酸合成水平的调控制,其生物合成途径如图1所示。

3工业酶制剂的应用（2）L-异亮氨酸的生物合成途径第五章-工业生物催化剂课件3工业酶制剂的应用3.3酶制剂的其他工业应用（1）果葡糖浆（2）丙烯酰胺（3）手性化合物等3工业酶制剂的应用3.3酶制剂的其他工业应用4酶制剂的改性和提高4.1改性的目的、意义随着丙烯酰胺、长链二元酸等大宗产品逐渐走向市场，许多关于生物催化技术的探索研究也广泛地开展起来，并在一些领域取得了可喜成果。

但是，目前工业酶催化的生产过程还是比较有限，主要原因在于：①酶的种类少；②目前酶的活性、耐温性、耐酸碱变化等性能比较差。利用生物技术对现有的酶进行改性研究，提高酶的活性和耐久性，拓宽了工业生物催化剂应用的领域，使其更有工业应用前景。近年来，这方面工作的研究主要集中在极端菌的探索，非水相酶的研究以及分子水平的定向进化、合理化设计等。

4酶制剂的改性和提高4.1改性的目的、意义4.2改性的手段（1）极端菌的研究近年来，人们发现一些菌在高温、寒冷、强酸碱、高盐浓度、高压等一般生物无法生存的极端条件下任然可以生存，这些菌统称为极端菌。对这些极端菌进行研究，有望逐步解决工业微生物对温度和环境依赖性等缺陷，增强在工业上的应用前景。

极端菌包括嗜高温菌、嗜低温菌、嗜盐菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜压菌等。4.2改性的手段（1）极端菌的研究4.2改性的手段（1）极端菌的研究嗜高温菌目前在工业上可以有两种用途：一是利用菌体产生的酶进行高温下的反应。如嗜热古细菌Thermusaquoticus中分离出来得TaqDNA聚合酶可以用于PCR技术。二是利用菌体发酵。如用极端嗜热菌生产乙醇，在高温下进行这一反应，可以把生产和分离结合起来，消除乙醇的产物抑制作用。

其他极端菌在发现地和结构上也各有特点，决定了它们的不同工业用途。如由于嗜盐菌在高盐浓度下稳定，它可用作低含水体系的催化剂。4.2改性的手段（1）极端菌的研究4.2改性的手段（1）极端菌的研究另一方面，利用基因工程技术将极端微生物特殊功能基因片段转入一般微生物体内或将一般微生物特异基因片段导入极端微生物中，从而改造受体的生理功能，甚至创造新的物种也是一种很好利用极端菌的方法。4.2改性的手段（1）极端菌的研究4.2改性的手段（2）非水相酶催化水是酶促反应最常用的反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物（底物）在水介质中难溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。是否存在非水介质能保证酶催化？4.2改性的手段（2）非水相酶催化但对于大多数有机化合物来说4.2改性的手段（2）非水相酶催化1984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。4.2改性的手段（2）非水相酶催化4.2改性的手段（2）非水相酶催化酶非水相催化的几种类型：有机介质中的酶催化气相介质中的酶催化超临界介质中的酶催化离子液介质中的酶催化4.2改性的手段（2）非水相酶催化4.2改性的手段（2）非水相酶催化酶在有机介质中由于水分子的减少，相对来说酶分子的构象表现出比水溶液中更具有“刚性”特点。因而使通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些特性成为可能。例如在有机溶剂中，可以利用酶与配体的相互作用性质，诱导改变酶分子的构象，调控酶的底物专一性,、立体选择性和手性选择性等。由于引起酶变性的许多因素都与水的存在有关,因此在有机介质中酶的稳定性得到显著提高。由于有机溶剂的存在,水量减少，大大降低了许多需要水参与的副反应，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基转移等。在有机介质中进行的酶促反应，可以省略产物的萃取分离过程,提高收率。4.2改性的手段（2）非水相酶催化酶在有机介质中由于水分子的4.3酶改性的两种方法（1）合理设计基于对蛋白质结构、功能和机制的详细了解，可以预先思考出氨基酸序列精确地改变，然后通过定点突变的方法引入这些改变。优点：能优化所需的性质，极大地提高对于酶结构与催化机制的认识。缺点：由于对提高酶性质的内在机制不够了解等原因，多数的实验是失败的。4.3酶改性的两种方法（1）合理设计4.3酶改性的两种方法（2）定向进化定向进化不需要关于酶结构与功能关系的认识，采用一种随机的过程产生一个巨大的变异基因库，然后通过基因选择或者高通量的筛选方法确定出具有性质改善的变异型。模拟自然进化的关键步骤——突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效改造蛋白质，使之适于人类需要。4.3酶改性的两种方法（2）定向进化4.3酶改性的两种方法（3）合理设计与定向进化的比较合理设计定向进化蛋白质结构的知识需要不需要对于机理的了解需要不需要点突变倾斜没有偏向转变二级结构设计可实行不可实行功能区设计可实行不可实行灵敏的酶的检定需要不需要选择方案不需要需