辣根过氧化物酶标记课件

实验原理（1）免疫标记技术免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。1实验原理（1）免疫标记技术1（2）辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的原理a.辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP）

HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm／OD275nm的比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的纯度。

HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。

HRPDH2＋H2O2────→D＋2H2O（2）辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的原理2b.辣根过氧化物酶标记方法酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。3b.辣根过氧化物酶标记方法3

在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想。用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果，但费用较贵。

4在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理

四操作步骤

（1）称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。（2）向溶液中加入0.5ml新配的0.1MNaIO４溶液，混匀，4℃静置30分钟。（3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀，静置30分钟。（4）加入含5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9.5碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜。

5四操作步骤5（5）加0.2mL新配的5mg/mLNaBH４液，混匀，再置4℃,2h。（6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h。（7）3000r/min离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/LpH7.4的PBS中。（8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15moL/LpH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。6（5）加0.2mL新配的5mg/mLNaBH４液，混酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。7酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作由于辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm／OD275nm的比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。8由于辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidaHRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:

HRP

DH2＋H2O2────→D＋2H2O供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。9HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2另外，还有一种供氢体称ABTS[2,2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H２O２已消耗殆尽）。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。10另外，还有一种供氢体称ABTS[2,2'-边氮基-双(3-HRP标记抗体的方法酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。11HRP标记抗体的方法酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构戊二醛二步法1.原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。12戊二醛二步法1.原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分2.标记步骤：(1)称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。

(2)反应后的酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。

(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。

(4)用1MPH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。132.标记步骤：(1)称取HRP25mg溶于1.25％戊二(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。

(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。(7)

3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。

(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。14(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。

3.结果判定：(1)定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定(见本节(三)工作浓度的选择)。153.结果判定：(1)定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗

(2)定量和克分子比值测定：

(2)定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4

IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62酶量(mg／ml)

IgG量(mg／ml)酶量克分子比值＝────────÷───────＝───×4

40,000

160,000

IgG量16(2)定量和克分子比值测定：16注意事项（1）为提高标记效率，应严格掌握整个反应体系中9的抗体含量。（2）碘酸钠要新鲜配制。（3.）室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液17注意事项（1）为提高标记效率，应严格掌握整个反应体系中9的抗注意事项

（4）在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高,效价高(最低1∶16),纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。（5