交联剂对大豆蛋白疏水性的影响

交联剂对大豆蛋白疏水性的影响

0戊二醛与伯胺的反应作为纺织和造纸行业的原料，五二醇二羧基二羧基可用于固定产品的外观。这是已知的磺酸类中最好的蛋白质交联剂。酚类物质的反应主要是氨基酸和氨基酸。也有人认为，只有含有这种结构的带独对电子的氨基才能反应能力，并且双官能团化合物可以形成结合效果。这些假设表明了许多试验事实，但它们与反应的性质无关。众所周知，由脂肪醇生产的异丙醇是不可逆的，因此五二醇也与阿拉伯胺生产的类似异甲基醇相似。然而，这种反应是可逆的。由脂肪醇生产的异丙醇是不稳定的，生物很容易被分解。通过模型实验，两位科学家在原子法、铬谱法、红外光谱、磁共振成像和质量分析等方面研究了五二醇和蛋白质的反应。他们认为，由二羧胺产生的异丙醇和碳碳的双键形成一个共轭体系统，通过共振稳定结构，提高了产品的薄水性。根据大量试验的结论，五二醇与蛋白质的结合可以有两种形式：分子和分子。五二醇可以与蛋白质结合。考虑到五二醇的许多优势，我们在本实验中选择了五二醇作为大豆蛋白质的共结剂。交联剂使氨基酸基团结合紧凑,不挥发的交联剂可能对蛋白质氢键及离子键有溶剂效应.有关文献报告,表面疏水性与乙酰化基团的数目成线性增加关系.圆二色性分光镜数据表明,乙酰化后二级结构几乎保持不变.二硫键链间作用和链内作用保持了结构的稳定性.蛋白分子与乙酰基交联的数目越多,蛋白质的表面疏水性越大.在变性温度下,7S分子的一些部分构象发生改变,因此促进了蛋白质与蛋白质和(或)蛋白质与溶剂的作用.1材料和方法1.1实验原材料大豆分离蛋白(SPI)样品,郑州油脂化学集团东方蛋白公司.1.2实验方法1.2.1缓冲溶液的配制配制0.2mol/LpH5.8~8.0的系列磷酸缓冲液.各pH值的溶液均由标准磷酸缓冲液校对,再将其分别稀释成0.01mol/L的磷酸缓冲溶液.1.2.2测定大豆蛋白质含量用福林酚法(Folin-phenol)测定溶液中大豆蛋白的含量.1.2.3乙酸酐用量对spi溶液发展的影响分别用戊二醛(浓度分别为0.5%、1.0%和2.0%),乙酸酐(浓度分别为1.23%、2.45%、3.06%和4.46%)做交联剂处理SPI溶液.1.2.4样品溶液的均质采用ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸)荧光探针法,将蛋白质样品溶于0.01mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液中,配成浓度为10mg/mL的分散体系,在高速均质机上均质1min,然后离心(3000r/min,20min)取上清液并用同一磷酸缓冲液逐步稀释(浓度约在0.002%—0.1%之间)后,取不同浓度样品的溶液10mL;分别加入50μl浓度为8.0mol/L的ANS溶液,振荡,静置3min,然后测定样品的荧光强度(FI).本实验中,激发波长λex=338nm,发射波长λex=496nm.以荧光强度对蛋白质浓度作图,初始段的荧光强度与蛋白质浓度Q值即为蛋白质分子的表面疏水性指数(So).1.2.5测定大豆蛋白质粘度的性能用NDJ-7型旋转式粘度计测定SPI样品的粘度.2结果与讨论2.12'醇对豆精华的稀释水处理2.1.1spi与b.nh2+ohc33.2.3常温下用戊二醛处理SPI,ANS荧光测定的疏水性指数见表1.结果表明,在本实验条件下,在低pH值下戊二醛与蛋白质的反应进行得很慢,随着pH值升高,反应速度加快.与对照相比,戊二醛处理SPI的疏水值均增大;pH值升高,所测样品S0值增大;在一定程度上戊二醛浓度增加,SPI的S0值增大,但浓度继续加大(如浓度为2.0%)时,S0值有所下降.戊二醛与蛋白质的反应主要是羰基与蛋白质分子中的氨基反应:P−NH2+OHC−(CH2)3CHO→P−N=CH−(CH2)S3Ρ-ΝΗ2+ΟΗC-(CΗ2)3CΗΟ→Ρ-Ν=CΗ-(CΗ2)S3CH=N-R+2H2O从试验现象来看,戊二醛与SPI反应后蛋白质颜色明显变化,由乳白→淡黄→浅黄褐色,浓度越大颜色越深.分析原因这是由于pH值升高,SPI溶解性增大,戊二醛与SPI反应更充分,暴露出较多的非极性疏水基团,与ANS结合后荧光强度加强从而表现疏水指数上升;在低SPI浓度下,低浓度戊二醛与SPI反应使蛋白质分子部分变性,溶液粘度增大(见图5)疏水性提高(见图1~图3);但浓度增加到2.0%时,SPI凝沉较多,在此过程中一些疏水基团参与了蛋白质分子的凝聚作用而与ANS结合力减少,导致S0值降低(如图3).2.1.2温度和温度对s0值的影响实验数据表明,用戊二醛处理SPI,与空白样相比,温度升高加快反应,S0值均有不同提高(如表1~表3);从实验现象看来,加热后SPI较未加热处理样品颜色深,温度越高颜色越偏深黄褐色.从表上可知,戊二醛浓度为0.5%、pH7.6和温度70℃下S0值相对最大(如图4);浓度为1.0%、pH8.0和温度40℃有最大S0值;浓度2.0%、pH8.0和温度40℃下有相对最大S0值.由此看来,提高S0值受综合作用的影响;表1~表3中戊二醛浓度较低,温度上升至70℃时有最大S0值,继续升温最大S0值反应减小了;温度升高,各pH值下的S0值均增大,而当温度上升至70℃时,最大S0值减小.分析结果,这可能是因为戊二醛不易溶于冷水而易溶于热水,温度升高扩散速度加快,戊二醛与SPI反应加剧,更多的SPI分子伸展开,破坏了蛋白质分子的紧密球状结构,多肽键松散,二级结构被破坏使得疏水性增大;而温度再高时,由于本实验中SPI溶液浓度较低(1%),SPI完全变性,二级结构破坏太多不利于分子的疏水性,表面疏水性指数降低.从图4可知,pH值一定条件下,温度升高、浓度增大在一定范围内使S0值增大,如在0~1.0%浓度范围内SPI的S0值呈增大趋势,同时温度上升S0值可达最大值(0.5%、70℃),此后,浓度和温度再升高时,最大疏水值反而减小.2.2酰化和乙酸酐的作用机理表1~表3反映出SPI表面疏水性指数随乙酸酐浓度和温度变化的情况.由图6及图7可以看出,与对照相比,S0值均有较大提高;尤其是在加热条件下,乙酸酐与蛋白质交联后疏水性大大提高,最大疏水性值比空白样的S0值提高了6倍左右.乙酸酐可以与大豆蛋白结构中的氨基上反应,其反应式为:蛋白质—NH2+O(COCH3)2————→蛋白质—NH—CO—CH3+CH3COO-+H+由于氨基酸和羧基酰化作用,使带正电荷的氨基转移到带中性的残基上减少了蛋白质的正电荷,蛋白溶液粘度增大,凝聚性降低.酰化可以提高蛋白质表面疏水性,酰化对蛋白质表面疏水性的影响可能由酰化引起蛋白质构象改变导致大疏水性基团的暴露程度和导入外源基团的疏水程度共同决定.在低交联程度下,酰化引起蛋白质的结构变化较为剧烈,蛋白质表面疏水性的增加主要来自蛋白质分子构象的变化.高酰化程度下,酰化使蛋白质结构变化减缓,导入外源基团的疏水性在蛋白质表面疏水性增加中的作用越来越突出.图6及图7中疏水值基本呈上升趋势,但在图8中却出现“尖点”现象,图9反映出在中性环境条件下,不同温度下乙酸酐浓度对SPI疏水性的影响变化情况.从表3可知,pH7.0、温度为70℃和浓度为3.29%的乙酸酐与大豆蛋白交联时疏水性最大.这可能是60℃以上高温减弱了球蛋白四级结构的结合力,并导致蛋白质亚基的打开,随即粘度增加.蛋白质变性时,蛋白质分子的紧密结构被破坏,多肽链充分舒展,促使分子的体积增大.粘度则是由相对分子质量和形状大小所决定的,当分子的相对分子质量一定时,则蛋白质的粘度就随着蛋白质分子的体积增大而增大.从粘度变化图上来看,当乙酸酐浓度提高一定程度、温度升高,粘度反而下降(见图10).分析原因,一方面可能是由于乙酸酐引起SPI分子结构的变化,疏水性基团暴露出来增加了疏水性;另一方面,乙酸酐与大豆蛋白分子交联并受热作用,分子运动加剧,冷却时蛋白质凝聚,造成SPI溶解度降低,粘度有所下降;而在可溶成份中,仍有众多暴露在分子表面的疏水性基团.由于疏水值实质上就是蛋白质荧光强度与溶液浓度的相关系数,蛋白质与ANS作用后荧光强度增大而溶液浓度却降低,那么所得的疏水值就大增了,也就是说大豆蛋白分子的疏水性大大提高了.3交联剂用量的影响大豆蛋白凝胶的疏水性交联剂戊二醛和乙酸