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文档简介

1/1亲和层析原理和步骤亲和层析AffinityChromatography

一、原理

亲和层析是利用生物大分子所具有的专一亲和力而设计的纯化技术查找配基配基固定化制成亲和层析柱

基本过程

固相化

+

吸附++洗脱

解吸+

载体

样品固相化

再生

常见具有专一性亲和力的生物分子对：酶：抗体：细胞：核酸：激素或药物：外源凝集素：基质类似物，抑制剂，辅酶抗原，病毒，细胞细胞表面特异蛋白，外源凝集素互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶受体，载体蛋白多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞

(一)载体的选择1、载体要求：(1)不溶性(2)渗透性：疏松网状结构，有良好的液体流淌性(3)化学和机械性能稳定(4)具备大量能被活化的基因(5)抗微生物和酶的侵蚀

2、常用载体(1)纤维素特点：价廉、来源充分纤维性、非均一性限制大分子的掺入非专一性吸附严峻用于抗体和酶的纯化(2)葡聚糖凝胶

特点：化学及物理性质稳定多孔性比琼脂糖低

(3)琼脂糖凝胶

浓度商品2%Sepharose2B4%Sepharose4B6%Sepharose6B

凝胶浓度越低结构越疏松机械强度越低

(4)聚丙烯酰胺凝胶

特点：物理化学性质稳定抗微生物侵蚀力量比琼脂糖强可供化学反应的酰胺基较多(5)多孔玻璃特点：不受微生物的侵蚀耐酸、碱、有机溶剂表面非专一性吸附

(二)配基的选择

1、对于欲纯化的物质应有专一亲和力2、必需具备能被修饰的功能基团

以酶和底物为例：KL

KL:解离常数E:酶L:底物EL:复合物

E+LELKL=[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL]E0、L0:起始浓度当L0》E0时KL=[E0-EL][L0]/[EL][EL]=[E0-EL][L0]/KLKd=结合酶/游离酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/KL

(三)固相化——将配体以共价键连接于固相基

质上制成固相化吸附剂

载体的排斥效应载体的空间障碍

二、亲和层析分别1、装柱和平衡2、上样、亲和吸附3、洗脱无效洗脱吸附效率不高有效吸附

洗脱方法(1)非特异性洗脱：转变

洗脱液pH值离子强度

梯度洗脱(2)特别洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体的连接键，再用透析或凝

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