验证报告-腹泻粪便标本中溶藻弧菌检验（市疾控、顺义疾控、延庆疾控）

《腹泻粪便标本中溶藻弧菌检验》标准验证方案及验证报告认证认可行业标准微生物检测方法确认与验证指南》、《GB/T20001.4-2015标准编写规程第4部分：试验方法标准》、《GB4789.28-2013食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂4.标准的检测限验证(杂菌干扰实验)第一部分标准实验室内验证方案3mm厚的琼脂层(直径90mm的平皿通常要加入18mL～20mL琼脂培养基),实时荧光PCR反应体系体积为20uL:2xPCRPremix板DNA2uL,水补足至20uL。引物和探针序列见表1。反应参数：95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃退火延伸20s,循环40表1溶藻弧菌实时荧光PCR引物和探针的序列及产物长度核苷酸序列(5'～3')产物长度HEXCACAAATTGCTCGTTCCACTGCCCACCBHCt值在35.0与40.0之间，需重新检测，如重测Ct值仍在此区间且曲线呈标e37℃~40℃干燥沉淀2min～5min,至沉淀表面无明显水迹仪器参数设置击数：每图谱40次(6次激光累积);激光频率：60.0Hz;离子源加速电压：20kV。结果判读MALDI-TOFMS鉴定结果给出数据库中与鉴定菌种最为匹配的10个菌株种属，并给出相对应的匹配分值，分值6分以下不可信，6-9分需要查看十个明细，9分以上种水平可信。可疑菌落经MALDL-TOFMS鉴定为溶藻弧菌，且匹配分值大于等于9分，牌和型号请参见仪器说明书。)2.4结果评价及报告记录结果，填写附表2,并将结果评价填于报告单上3标准的排他性验证3.1试剂的准备同2.13.2菌株的准备北京市通州区疾病预防控制中心的标准储备菌株和检出的各种保存菌株20株，见表2;及溶藻弧菌的近源菌株6株，见表3,于脑心浸液肉汤中培养过夜，序号菌株名称序号菌株名称1大肠埃希氏菌CICC23657金黄色葡萄球菌CICC236562弗氏柠檬酸杆菌CICC10404金葡20171893产气肠杆菌CICC10293金葡20171904小肠结肠炎耶尔森氏菌5肠炎沙门氏菌CICC21513蜡样20210816鼠伤寒沙门氏菌CICC21484蜡样20211057单增李斯特CICC216358单增20210789单增2021079宋内志贺菌CICC23875单增2021080序号菌株名称序号菌株名称1副溶血性弧菌CICC216174创伤弧菌CICC216152霍乱弧菌CICC237895嗜水气单胞菌201918636类志贺邻单胞菌20123203.3验证分别用VITEK系统生化鉴定、荧光PCR方法、MALDI-TOFMS三种方法对26株菌进行鉴定。方法同2.3。3.4结果评价及报告记录结果，填写附表3,并将结果评价填于报告单上。4标准的检测限验证(杂菌干扰实验)4.1材料：3%氯化钠碱性蛋白胨水10ml/支，50支；VITEKGN卡50测试(5℃保存);荧光PCR试剂(-20℃保存);溶藻质控球(5℃保存);大肠埃希氏菌ATCC25922标准菌株(实验室标准储存菌株);0.85%生理盐水200mL;脑心浸液肉汤10mL/支，1支。度0.5,稀释度-4,则为10000CFU/mL～20000CFU/mL。将溶藻弧菌质控球(每个质控球100CFU～1000CFU,北京陆桥)1支溶于10取1毫升菌液加入到1份粪便标本中，共制作5份。取5毫升高浓度菌液(-1稀释度)加入到45毫升生理盐水中，混合均匀，此1份粪便标本中，共制作40份。4.4接种各取1份粪便标本加入1支10mL3%氯化钠碱性蛋白胨水中，高浓度5份、低浓度40份、对照标本5份，共50份。36℃培养8h～18h。按图1溶藻弧菌检验程序进行检测。出具荧光PCR初筛阴性阴性接种3%氯化钠碱性蛋白胨水增菌培养荧光定量PCR筛查(选做)接种TCBS和弧菌显色培养基，分离培养接种3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂荧光定量PCR方法(可选)煮沸10min,12000r/min离minPCR荧光PCR检测及结果判定同2.3.2。在TCBS平板和弧菌显色培养基平板上各挑取5个可疑菌落，划线接种3%4.5.4鉴定溶藻弧菌的鉴定可采用生化鉴定或MALDI-TOFMS鉴定或实时荧光PCR方法鉴定。三种鉴定方法操作同2.3。4.6结果与报告将荧光PCR初筛、生化鉴定、荧光PCR鉴定、质谱鉴定检测结果填写附表4附表1选择性分离培养基验证报告单附表2标准的包容性验证报告单附表3标准的排他性验证报告单附表4标准的检测限验证报告单地址：北京市通州区潞河中学北街1号手机二部分标准实验室间验证方案标准的检测限验证(杂菌干扰实验)1材料：3%氯化钠碱性蛋白胨水10mL/支，50支；弧菌显示培养基50皿；VITEKGN卡50测试(5℃保存);荧光PCR试剂(-20℃保存);溶藻质控球(5℃保存);大肠埃希氏菌ATCC25922标准菌株(各实验室储存菌株);3%氯化钠胰酪胨大豆琼脂200mL高压备用；0.85%生理盐水200mL;脑心浸液肉汤10mL/支，1支。2干扰菌液准备大肠埃希氏菌ATCC25922接种于10mL脑心浸液肉汤中过夜培养。调菌液浊度0.5,稀释度-4,则为10000CFU/mL～20000CFU/mL。荧光PCR检测无溶藻弧菌核酸的腹泻病人粪便标本，高压后分成1g/份，共50份。每份粪便标本加入1000CFU～2000CFU干扰菌大肠埃希氏菌ATCC25922 (菌液0.1mL)。此50份粪便即为模拟腹泻病人粪便的标本。A人工染菌高浓度粪便标本制备将溶藻弧菌质控球(每个质控球100CFU～1000CFU,北京陆桥)1支溶于10毫升生理盐水中，混合均匀为原液，取2毫升原液溶于18毫升生理盐水中，混合均匀，此-1稀释度菌液即为高浓度菌液(预定浓度为1CFU/mL～10CFU/mL)。取1毫升菌液加入到1份粪便标本中，共制作5份。B人工染菌低浓度粪便标本制备取5毫升高浓度菌液(-1稀释度)加入到45毫升生理盐水中，混合均匀，此菌液即为低浓度菌液(预定浓度为0.1CFU/mL～1CFU/mL)。取1毫升菌液加入到1份粪便标本中，共制作40份。另取5份粪便标本不添加溶藻弧菌菌液，即为对照标本。各取1份粪便标本加入1支10mL3%氯化钠碱性蛋白胨水中增菌，高浓度5份、低浓度40份、对照标本5份，共50份。36℃培养8h～18h。5检测按图1溶藻弧菌检验程序进行检测。出具荧光PCR初筛、生化鉴定、荧光阴性阴性筛查(选做)图1溶藻弧菌检验程序上清，加入500uL无菌超纯水，充分混匀后制成肉眼可见的混浊菌悬液，煮沸10min,12000r/min离心5min,取上清液用于PCR检测。也可利用细菌基因组提取试剂盒提取DNA,操作方法按试剂盒说明书进行。实时荧光PCR反应体系体积为20uL:2×通用PCR反应混合物(PremixEx模板DNA2uL,水补足至20uL。引物和探针序列见表1。反应参数：95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃退火延伸20s,循环表1溶藻弧菌实时荧光PCR引物和探针的序列及产物长度引物核苷酸序列(5'～3')产物长度COLPHEXCACAAATTGCTCGTTCCACTGCCCACCBHQ同5.1.2。附表1菌株号弧菌显色培养基上菌落特征结果评价溶藻弧菌粪便中分离菌株附表2文名称)荧光PCR结果(Ct值)1234567附表3验证结果：生化结果(VITEK报告拉丁文名称)质谱结果(数值)荧光PCR结果(Ct值)1234567附表4筛结果(Ct值)文名称)荧光PCR结果(Ct123456789主要仪器信息：附表1验证单位：北京市通州区疾病预防控制中心菌株号弧菌显色培养基上菌落特征结果评价菌圆形、表面湿润光滑、大而扁平的黄色菌落，直径2圆形、水润、白色菌落，直径2mm～3mm,奶油状，有蔓延生长的趋势生长旺盛、状态良好粪便中分离菌株圆形、表面湿润光滑、大而扁平的黄色菌落，直径2圆形、水润、白色菌落，直径2mm～3mm,奶油状，有蔓延生长的趋势生长旺盛、状态良好1.TCBS北京市陆桥公司批号220722附表2《腹泻粪便标本中溶藻弧菌检验》验证单位：北京市通州区疾病预防控制中心序号样本号鉴定结果生化结果(VITEK报告拉丁文名生化结果可信度(%)丁文名称)荧光PCR结/阳性)荧光PCR(Ct1VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性2VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性3VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性4VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性5VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性6VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性7VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性8VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性9VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性球分离菌株VibrioVibrioalginolyticus阳性菌VibrioVibrioalginolyticus阳性的结果)。1.3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂北京陆桥公司批号2206172.VITEKGN卡梅里埃批号24121995033.质谱样本预处理试剂郑州安图生物批号202306051.VITEK微生物生化鉴定系统梅里埃VITEK2COMPACT30编号01-WJF108附表3验证单位：北京市通州区疾病预防控制中心序号样本号鉴定结果生化结果(VITEK报告拉丁文名生化结果可信度丁文名称)分荧光果(阴性/阳荧光1大肠埃希氏菌阴性2弗氏柠菌阴性一3产气肠阴性一4小肠结肠炎耶尔森氏菌阴性5肠炎沙门氏菌阴性6鼠伤寒沙门氏菌阴性 7福氏志阴性一8痢疾志阴性一9鲍氏志阴性一宋内志阴性一金黄色葡萄球菌阴性一阴性一阴性一蜡样芽胞杆菌阴性阴性阴性单增李阴性monocytogeneses阴性eses阴性2021080eses阴性副溶血性弧菌Vibrioparahaemolyti阴性菌阴性菌阴性菌阴性嗜水气单胞菌阴性类志贺菌SS阴性结果评价：三种鉴定方法对溶藻弧菌检验的排他性良好(生化对蜡样效果不好，质谱对志贺和产气肠杆菌效果不好)1.哥伦比亚血琼脂平板北京陆桥批号2306012.VITEKGN卡梅里埃批号2412211403VITEKGP卡梅里埃批号24223595033.质谱样本预处理试剂郑州安图生物批号202306055.荧光PCR引物和探针为上海生工合成1.VITEK微生物生化鉴定系统梅里埃VITEK2COMPACT30编号01-WJF1083.荧光PCR仪ABI-QuantStudio5(美国赛默飞公司)编号01-WJF195验证单位：北京市通州区疾病预防控制中心(盖章)附表4验证单位：北京市通州区疾病预防控制中心类别鉴定结果阴性/阳性生化结果文名称)生化结果可信度(%)质谱结丁文名荧光结果性/阳荧光高浓度1阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性2阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性3阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性4阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性5阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性低浓度6阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性7阴性////8阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性9阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阴性/////阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性阳性alginolyticus阳性VibrioalginolytiVibrioalginolyticus阳性阴性//////阴性/////阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阴性/////阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolytiVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性/////阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阴性////阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阴性//////阴性///阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolytiVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性Vibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性对照组阴性////阴性/////阴性////阴性//////阴性///主要培养基信息(培养基名称、生产厂家、批号):1.3%氯化钠碱性蛋白胨水，北京陆桥2304293.3%氯化钠胰酪胨大豆琼脂，北京陆桥2206175.质谱样本预处理试剂郑州安图生物批号20230605主要仪器信息(仪器名称、厂家及型号、单位编号):1.VITEK微生物生化鉴定系统梅里埃VITEK2COMPACT30编号01-WJF108验证单位：北京市通州区疾病预防控制中心(盖章)附表4增菌液荧光PCR(VITEK报告拉丁文名称)度(%)文名称)阳性)(Gt值)高浓度1VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus2VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus3YibrioalginolyticusVibrioalginolvuicus4VibrioalginolyticusVibrioalginolytieus5VibrioalginolyticusYibrioalginglytieus低浓度6VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus7VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus8VibrioalginolyticusVibrioalginolyuieus9VibrioalginolrticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusYibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticuYibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrloalginolyticusVibrioalginolyticusYibrioalginolyticusYibriealginolyticusVibrioalginolyticusYibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticus/////VibrioalginolyticusVibrioalginolyticusYibrioalginolyticusVibrioalginolyticusYibrloalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusYibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusalginolyticusVibrloalginolyticusYibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusalginolyticusVibrioalginolyticusYibrioalginolyticusalginolyticusYibrioalginolyticusVibrioalginolyticusalginolyticusVibrioalginolyticusVibrloalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginglyticusalginolyticusalginolyticusVibrloalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrioalginolyticusVibrloalginolyticusVibrioalginolyticusYibrioalginolyticusYibrloalginolyticusVibrioalginolyticus阳性YibrloVibrio阳性阳性VibrioVibrlo阳性阳性YibrioVibrlo阳性阳性VibrioalginolyticusVibrio阳性阴性//////阴性//////阴性/////阴性//////阴性//////1.3%氯化钠碱性蛋白胨水，北京陆桥2304294.弧菌显色培养基，科玛嘉P002736附表4验证单位：北京市顺义区疾病预防控制中心浓度类别阴性/阳性(Ct值)报告拉丁文名称)可信度(%)文名称)分荧光PCR结果(阴性/阳性)(Ct值)1阳性Vibrioalginolyticus阳性2阳性阳性3阳性阳性4阳性阳性5阳性阳性低浓度6阳性Vibrioalginolyticus阳性7阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性8阳性Vibrioalginolyticus阳性9阴性N/A///阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阴性//////阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性Vibrioalginolyticus阳性阴性N/A//阳性Vibrioalginolyticus阳性阳性Vibrioalginolyticus阳性阳性Vibrioalginolyticus阳性阴性////阳性Vibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusYibrioalginolyticus阳性阴性N/A///阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阴性N/A////阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性alginolyticusVibrioalginolyticus阳性阴性N/A///1/阴性N/A////1阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性Vibrioalginolyticus阳性阳性Vibrioalginolyticus阳性阳性Vibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性Vibrioalginolyticus阳性阳性Vibrioalginolyticus阳性阴性///阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性Vibrioalginolyticus阳性阳性Vibrioalginolyticus阳性阴性N/A/////阳性Vibrioalginolyticus阳性阴性N/A////阳性alginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阴性N/A/////阴性N/A//////阴性/////阴性N/A////阴性N/A2023年09月12日附表4验证单位：北京市延庆区疾病预防控制中心浓度类别鉴定结果阴性/阳性(Ct值)生化结果(VITEK报告拉丁文名称)生化结果可信度(%)荧光/阳性)荧光高浓度1阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性2阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性3阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性4阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性5阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性低浓度6阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性7阴性//////8阴性///////9阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阳性VibrioalginolyticusVibrioalginolyticus阳性阴性///////阳性VibrioalginolyticusVibrioalgino