染色体显带技术的研究进展

染色体显带技术的研究进展

染色显带技术适用于研究不同（包括不同细胞类型和不同物种）生物学材料的矩阵结构。这在很大程度上取决于早期染色体的分离和早期分析。许多特殊的染料将中期染色体识别为均质的结构,然而某些染色方法能产生具有种属特异横纹的差示染色带,并且这些显带图型在发育过程中以及不同组织的细胞间是恒定的。染色体显带方法有的以染料为基础,有的以功能为基础,常用的基于染料的染色体显带技术有:C显带技术(着丝粒-Centromere),Q显带技术(荧光染料喹吖因-Quinacrine),G显带技术(吉姆萨染料-Giemsa)和R显带技术(相反-Reverse),这些方法均可用于哺乳动物染色体显带。应用最广的基于功能的染色体显带技术为复制显带技术。1根据染料的染色技术1.1萨染料的预处理C显带技术包括对染色体一系列酸碱处理,热标准枸橼酸溶液(SSC)温育以及随后的吉姆萨染色过程。吉姆萨染料是一种混合染料,含有伊红Y和天蓝B等蓝噻嗪类化合物。不经预处理,吉姆萨染料可使哺乳动物中的染色体着染为均匀的紫色。C阳性带通常识别组成型异染色质,后者含有高度重复的卫星DNA,一般包括着丝粒和其他非着丝粒区,这种显带技术被认为是由于在预处理过程中选择性地保留了C带DNA而丢失了非C带DNA的结果。1.2g显带染色G显带技术是采用吉姆萨混合染料的方法首先用秋水仙素或秋水酰胺使细胞停滞于分裂中期,经胰蛋白酶溶液的消化,再加入KCl低渗溶液,使细胞膨胀,经预固定,固定,重固定滴片后染色,据认为G显带技术中,DNA和蛋白质均与染料的麦硫因和伊红成分作用,G阳性带为富含AT的DNA区。目前对G显带技术的机理认为吉姆萨分子更有可能被捕获到胰酶消化G带产生的沟内。G显带技术是目前应用最广泛的显带方法之一。1.3以姆萨染色为主R显带技术是相对于G显带技术的相反显带技术,最常采用的程序是将染色体预热(87℃)的酸性盐水中部分热变性处理,再以吉姆萨染色,据认为该法优先使富含AT的DNA变性,随后将富含GC的DNA区着染。R显带技术和G显带技术产生的染色带型呈互补性(G阳性带为R阴性带),这两种显带技术可能揭示了染色体上同一基本现象的相互关联的两个方面。在某些R显带程序中采用吖啶橙替代吉姆萨染料产生绿/黄色荧光的R带(DNA双链区域)和橙红色的G带(DNA单链区域)。1.4亚带-变色深的r带T显带技术采用比R显带技术更为剧烈的热处理或者联合应用染料或荧光素识别R带亚带-着色最深的R带。据认为,该法识别最富含GC的R带,这样富含GC的R带通常位于端粒处,由此推测所有的T带均起始于染色体末端,T显带技术的机制与R显带技术相似,即除了富含GC的区域外,所有DNA区域均发生变性。1.5氧漂后羟基a-3-甲基苯磺酸酯gc的合成1968年,Q显带技术首次报道用于人类和植物染色体常染色质臂的显带。该技术采用喹吖因或喹吖因芥子荧光染料,不需要对染色体预处理,这些染料与某些碱基发生特异性作用。采用该法完成了对人类全套染色体核型分析,将23对染色体一一分辨和鉴别。实际上Q显带技术在个体发育中的应用比G带和R带技术更为广泛。喹吖因分子在插入染色体DNA无序列选择性,但在富含AT的DNA区发出的荧光更亮一些,联合应用Q显带技术和氚标记揭示,喹吖因着染的染色体区段越亮,该区的AT含量越高。除喹吖因外,其他对富含AT的DNA特异性结合的荧光素还有Hoechst33258(2,2-[-羟基-苯基]-6-苯并咪唑-6-[1-甲基-4-派嗪]-苯并咪唑-(三伐虫脒)),DAPI(4′-6-二脒基-2-苯基吲哚),DIPI(4′-6-双[2-咪唑啉-4′-5′-H]-2-苯基吲哚),二丁基硫酸原黄素,道诺霉素和阿霉素。优先结合GC的DNA荧光素包括色霉素类抗生素:色霉素A3,光辉霉素和橄榄霉素以及7-氨基放线菌素D的荧光衍生物。也可联合应用染料进行染色体显带以增强显带效果,一般认为,荧光素显带技术反映了染色体中DNA碱基组成的某些变化。2染色体的复制复制显带技术:细胞周期的S期(复制期)真核生物基因组的不同区域在不同的时间复制,这反映了基因组结构与DNA复制过程的暂时控制之间的必然联系。研究复制的时机与染色体显带间的关系,采用的方法是将胸苷类似物(或者为氚标记的胸苷或者为5-溴-2′-脱氧尿苷[Brdu])脉冲掺入处于细胞周期S期特定阶段的活细胞,随后检查中期染色体。根据Brdu减弱Hoechst33258、吉姆萨、吖啶橙或DAPI的染色效果可间接检测Brdu掺入位点,也可用抗Brdu抗体直接检测变性DNA上Brdu抗体的掺入位点。3显带染色体的记录近来,对染色体显带技术的主要需求之一是鉴别荧光原位杂交(FISH)后探针杂交位点,因此,某些以荧光为基础的显带技术成为首选。尽管在原位杂交前后也采用以吉姆萨为基础的显带方法,但需要仔细记录有杂交信号的显带染色体。有各种荧光素显带技术可与FISH同用,复制显带技术可与Brdu掺入法同用,杂交后经荧光标记的抗Brdu抗体检测,通常在FISH中采用的DNA复染剂有DAPI、PI和Hoechst33258-单独使用或彼此联合使用,在FISH后获得良好显带效果的报道有色霉素A3/偏端霉素A,Hoechst33258/PI,Brdu/PI,Brdu/Hoechst33258。4染色粒型的选择减数分裂粗线期染色体不经预处理,即可着染,产生浓染的带型,凝聚的“染色粒”被凝聚程度较低的染色粒间DNA分开,每一条减数分裂染色体都有一个特征性的染色粒图型,对应于中期染色体显带图型,其染色粒相当于有丝分裂G带,它们被DAPI亮染,但不为色霉素着染。例外的是某些端粒染色粒,它们是有丝分裂中期的R带。5序列及序列表现为补连锁离子上的抑制剂通常认为活动基因的染色质比失活基因染色体更易于被核酸攻击,在固定的有丝分裂染色体上似乎仍保留这种差异。将染色体经DNaseI消化,然后利用标记的核苷酸从切割位点处进行缺口翻译所呈现的有丝分裂染色体上的DNaseI敏感位点似乎主要对应于R带。识别序列富含GC的限制性酶总是对R带呈现较强的消化作用,识别位点含GC二核苷酸的限制酶通常主要消化T带。然而,用识别位点富含AT的限制性酶进行研究显示出G带和R带的优先消化作用,或者其消化作用完全无带型特异。普通中性识别序列的酶通常仅使C带保持完整,因此由限制酶产生的显带图型不仅仅与染色体上酶识别位点的分布有关。6抗b-甲基胞监型将中期染色体与抗染色体DNA或蛋白质组分的抗体反应,可产生各种不同的染色体显带图型。这是一种研究染色体结构的方法,通常采用细胞离心法将未固定的低渗膨胀细胞悬液散布在玻片上,然后用非离子去污剂渗透细胞膜,使抗体接近染色体,在与一级抗体和二级抗体温育后,通常将玻片以甲醛固定,随后进行FISH以便共同定位有丝分裂染色体上的蛋白质和DNA。变性的染色体与抗核苷酸特异性抗体反应产生与荧光显带图型相一致的染色体显带图型,不同带间存在着碱基组成的差异。抗A抗体优先结合G带,抗C抗体优先结合R带。此外,抗多dGdC双链DNA的抗体识别R带,抗修饰碱基5-甲基胞嘧啶(5-Mec)的抗体主要结合哺乳类染色体的组成型异染色质区域。这些抗体包括抗甲基化CpG结合蛋白MecP2的抗体以及抗含色结构域的蛋白M31的抗体。这些图型反映了DNA修饰程度的差异以及异染色质与常染色质结合的染色体蛋白类型的差异。7dna显带及光谱分析技术FISH可获得因染色体DNA一级序列的性质不同而呈现的显带图型,因此利用DNA探针通过FISH进行的染色体显带技术有了进一步的发展。研究表明SINE家族的重复序列具有整合R带DNA中的优势,而LINE重复序列似乎偏向于G带DNA。目前SINE和LINE探针均已用于进行显带以便利用单拷贝探针经FISH对哺乳类染色体精确定位。在中期染色体上碱基组成不同的DNA组分(等位群)也产生显带图型,其大多数富含GC区重染为T带。DNA杂交显带技术的染色体特异性“染料”其实是FISH探针,含有复杂DNA序列,与单基因座FISH探针检测单染色体位点相反,它们一般用多种荧光染料混合标记,能与染色体上大的可见区域杂交并将其重染。进行全套核型分析的方法是用多种荧光染料混合标记的染色体染料和可将其分辨的特定的狭带滤镜进行详细的光谱分析即所谓光谱核型分析(SpectralKaryotyping)。特异性染料可根据由流动分类的染色体或体细胞杂合体制备的DNA获得。8细胞杂合体的体外染色体G11显