糖尿病足实验动物模型研究进展

糖尿病足实验动物模型研究进展

糖尿病是指由糖尿病血管病变（或）引起的由单或多环芳烃引起的糖尿病患者的足部或下肢组织损伤引起的疾病，这是糖尿病患者的严重并发症。临床上,糖尿病足患者普遍存在两种因素以上复合致病的现象,同时各个因素对该病严重程度的影响比重也不同。学者依此建立了糖尿病足的分类分级标准。研究者针对糖尿病足特定类型及分级建立的模型也不尽相同,就总体阶段而言,糖尿病足实验动物模型的建立可分为糖尿病模型的建立、组织破坏的制备和模型的评价3个部分。其中糖尿病模型基本采用链脲佐菌素(STZ)化学药物诱导建立,此方法较为成熟,而组织破坏的方法与评价指标尚无统一标准。实验动物模型的建立通过基因修饰、手术和物理、化学诱导等方法,可分为模拟疾病病理改变的“病”的模型和模拟疾病症状体征的“证”的模型。本文将糖尿病足实验动物模型分为模拟病理改变的单因素/“病”模型,模拟病理与体征的多因素/“病”“证”模型和模拟临床症状体征的其他/“证”模型分别予以论述。1对大鼠的诱导根据模拟的病理因素分为缺血性动物模型、神经病变性动物模型和感染性动物模型。考虑到实验时间、操作及经济因素的限制,研究者多选用大鼠作为实验动物,少数介入类研究选用犬。大鼠糖尿病的复制有采用STZ药物诱导和高脂饲料结合STZ两种方法,后者建立的糖尿病模型更接近2型糖尿病的发病过程。犬糖尿病则采取切除胰腺的方法复制。模型的评价标准根据各自建立的方法而定,以客观量化、稳定性指标为优。1.1血管内皮活检根据糖尿病足的血管病变建立糖尿病缺血性动物模型,实验动物多选取大鼠,大鼠糖尿病采用STZ诱导建立,犬糖尿病则用手术切除全胰腺组织的方法制造。后肢缺血的制备采取直接切除或结扎血管的方法,模型缺血状态的评估中激光多普勒(LDPI)测定下肢血流变化或皮肤血流灌注量降低的方法相对客观准确,便于缺血程度的判断和疗效的比较,可作为重复试验中判断模型差异的参考指标;或者以观察到的缺血体征作为判断标准,该方法在临床评价缺血性糖尿病足患者的预后方面意义重大,但对动物模型的判定主观差异性过大,不建议作为评价动物模型缺血主要指标。在切除或结扎血管的具体方法上,LévigneD等对后肢动脉血管进行分段处理,将髂外、股和隐动脉全部切除制成后肢严重缺血模型,以研究高血糖对严重缺血肢体损伤的机制。赵玉明等对后肢动静脉血管包括股动、静脉及周围血管全部进行结扎建立后肢急性缺血模型,以研究创面愈合的机制。然而,采取动脉高位切除或结扎造成后肢急性严重缺血坏死的病理改变与糖尿病足的中小动脉病变为主的慢性缺血状态有较大差别。李晓军等通过肢体股动脉内置入一根螺旋状金属丝,造成下肢不完全缺血的状态。此方法较为接近糖尿病足慢性缺血状态,但血管自身的病变程度却未予说明。大鼠具有血管分支多,侧枝循环建立时间短的特点,采用血管切除或结扎方法造成的缺血多数为急性缺血病理改变,其中血管切除/结扎中分段结扎造成的缺血模型较为可靠。动脉粥样硬化的血管病变与糖尿病足血管病变病理过程及体征表现方面较为相似,故动脉粥样硬化模型建立方法也被应用于糖尿病足模型建立。王纤汝等采用高脂饮食(胆酸钠0.5%,胆固醇1%,猪油5%,蛋黄粉10%,基础饲料83.5%)4周结合STZ诱导糖尿病,8周后自然形成溃疡从而建立糖尿病足模型。高脂饲料结合STZ建立的糖尿病与人类2型糖尿病的发病机制较为相近,长期的高血糖状态自发产生的糖尿病足符合临床实际。采取此种方法的研究较少,可能与血管病理改变的直接证据不足、模型建立周期较长、坏疽的程度不可控、模型的统一性和稳定性较差有关。增加血管组织学指标,明确血管组织学改变后配合其他方法制备溃疡可明确病理改变,缩短模型建立周期,增加模型稳定性和应用范围。糖尿病建立后除了直接对血管进行手术或药物干预造成缺血外,有学者采用降温/冷冻法,通过降低大鼠肢体温度造成远端肢体血液供应障碍,建立糖尿病足模型。陈群力等采用控制室温、梯度降温的方法,祝亚男等在此基础上通过游泳、冰块降温和液氮涂抹加以改进,虽增加了模型建立的复杂性,但缩短了建立模型的时间周期,同时溃疡部位也较为可控。降温/冷冻法通过使血管痉挛,减慢血流速度,造成细胞水肿从而使肢体组织处于缺血状态,造成肢体变黑坏死的症状与缺血性糖尿病足极为相似。但这与糖尿病足血管病变机制差别较大,产生的溃疡形态和程度难以控制,同时建立过程繁琐,应用较为局限。外在的异常应力导致的局部缺血也是造成糖尿病足溃疡常见的原因。葛良鹏等参考ReidRR法,利用磁片循环压迫建立大鼠糖尿病溃疡动物模型。方法是先手术将磁片植入皮下,STZ诱导糖尿病,后在皮肤表面放另一磁片加压,每天施压2h-松解30min-施压2h,循环3次,以皮肤变黑、变硬、针刺不出血作为判断溃疡模型的标准。该模型根据缺血-再灌注原理,具有组织坏死、白细胞聚集以及高浓度晚期糖化终末产物等特征,坏死区域病理改变与临床糖尿病足发病较为相似,溃疡面积基本与磁片区域相同,便于测量,是评价溃疡愈合的较理想方法。但缺少压迫部位皮肤同步血流监测,无法直接客观说明压迫部位皮肤的缺血和复流交替过程。近10年针对糖尿病足神经病变建立的模型少见。KaleB等采取结扎神经的方法建立糖尿病神经病变模型,选择SD大鼠,在STZ诱导糖尿病基础上,手术分离并结扎坐骨神经使后肢发生溃疡坏疽。该模型可评价神经干多层次减压对糖尿病神经病变的疗效。该方法使大鼠保持长时间的高血糖状态,结合结扎的方法使神经发生病变从而产生溃疡较为独特,增加其病变神经的病理学指标明确病理,同时结合其他建立溃疡的方法缩短溃疡发生时间,是较为理想的研究糖尿病足神经病变的模型。感染是伴随和加重糖尿病足发展的重要因素,也是建立糖尿病足动物模型需要考虑的重要环节。现有的糖尿病足感染性动物模型的方法为皮下菌株注射,菌株为标准菌株或通过临床分离培养获得。其中JeremyRich等建立的金黄色葡萄球菌感染NOD小鼠后肢模型,将金黄色葡萄球菌(PS80)悬浮液10μl的深度注射到小鼠后爪的足底近端,并于6h、24h、48h、72h、5d后处死,进行创面细菌培养验证。该研究采用金黄色葡萄球菌感染的方法对糖尿病足模型的建立具有重要的借鉴价值。2免疫组化感染模型单因素糖尿病足模型的病因和症状与人类糖尿病足有较大差距,多因素模型较单因素模型采取2种或以上的方法进行制备,使动物模型的病理改变与临床糖尿病足更为接近。采用多因素复合的方法建立糖尿病足实验动物模型,在模拟临床表现方面更有优势。根据研究目的不同,研究者建立糖尿病足动物模型采取的叠加因素更为灵活。其中,彭艳等选用STZ诱导制备Wistar大鼠糖尿病模型,然后以射线照射抑制大鼠免疫功能,结扎双后肢股动脉,以大鼠结扎肢出现皮肤溃疡为模型判定标准,用Ⅷ因子免疫组化法观察腓肠肌毛细血管数及VEGF水平作为干预评价指标。该模型模拟糖尿病免疫功能下降及下肢缺血状态,可作为干细胞移植或药物干预的研究工具。糖尿病导致的免疫功能下降是糖尿病足感染的重要原因。张东萍等采用STZ诱导建立糖尿病大鼠模型,第8周后腹腔注射3%的猪胃黏蛋白,以降低大鼠机体免疫力,于大鼠后肢足趾部注射浓度均为1.5亿/ml尖端单孢子菌或绿脓杆菌或二者混合液0.1ml,从而在糖尿病大鼠基础上,通过腹腔注射猪胃黏蛋白降低大鼠机体免疫力、足部注射真菌或(和)细菌菌液的方法,建立糖尿病足动物感染模型。该模型较JeremyRich等的感染模型,更好地模拟了糖尿病免疫功能抑制状态下多种病原微生物混合感染对糖尿病足发展的影响,适当增加免疫学指标和病原微生物的验证,可成为糖尿病足感染的理想研究模型。单纯动脉结扎或皮肤压迫造成的缺血特征与糖尿病足中小动脉病变为主的缺血并不一致,联合这二种方法能够更好地模拟血管病变和皮肤组织灌注不足的情况。朱悦琦等选用毕格犬静脉注射四氧嘧啶诱导糖尿病,行下肢压迫器植入后,手术结扎同侧股动脉主干及主要分支,压迫器周围出现皮肤坏死后,去除压迫器完成模型建立。该方法为血管介入以及干细胞移植研究提供了一种稳定的大型实验动物模型,其溃疡的面积可控制,缺血程度较重,愈合时间较长,便于疗效评价。其不足之处在于操作较为复杂,经济花费较大。血管结扎配合皮肤组织破坏是模拟糖尿病足发病的常用组合。吕雅丽等选用STZ诱导的糖尿病Wistar大鼠,6个月后,裂隙灯检查表明有明显的白内障,神经和血管已发生相应的病理改变后,将后肢腘动脉下端结扎;1个月后进行皮肤烫伤(用圆柱形铁杵在沸水加热后立即对大鼠后肢足背部皮肤进行烫伤,使其得到深Ⅱ度烫伤)。该方法明确了中晚期糖尿病神经血管的内在改变,对大鼠后肢足背部皮肤烫伤模拟了糖尿病足的诱发因素。对血管神经病变使用白内障检查评定具有合理性,同时操作简单,结扎的血管为低位的腘动脉,保留了腘动脉与股动脉、小腿各动脉之间的侧支循环,这与糖尿病足慢性缺血状态下侧支血管建立过程相近。该方法建立周期约7个月,可较为真实模拟长期的高血糖状态对血管和神经的影响。其不足之处为实验周期偏长,动物死亡率较高。2.5血管样品硬化和皮肤化学燃烧模型3糖尿病足社会临床医学问题研究除直接模拟糖尿病足血管、神经病变和感染因素建立糖尿病足“病”的模型外,也有学者采取模拟糖尿病足临床体征症状的方法建立糖尿病足动物“证”的模型。TamJC,LauTW等选用5日龄Wistar大鼠,STZ诱导糖尿病后饲养10周,使用印章标记足背皮肤,全层切除造成标准面积溃疡。溃疡面积测量采用数码摄像结合计算机程序(IACP)进行分析。蔡黔等制作糖尿病与溃疡方法与之相同,其溃疡面积采用数码拍照结合Image-ProPlus.V6.0计算。AmosPJ等选择db小鼠,使用模具在背部做皮肤全层切除造成溃疡,放置标准尺数码摄像结合ImageJ软件进行创面面积分析。上述研究报道溃疡的制作方法简单,模型建立时间短,面积测量无需接触创面,简易实用,同时创面面积的量化分析符合临床疗效评价,尤其是外用辅料及药物的研究,可获得能够分辨新生上皮与肉芽界限的图像。该方法对设备和拍摄人员素质要求较高,同时标准创面越小计算产生的误差越大。皮肤切除造成的溃疡仅模仿糖尿病足溃疡的外在状态,与人类糖尿病足溃疡发生的原因有很大不同,不适合糖尿病足的机制性研究。糖尿病足神经病变导致的肌力变化、足趾变形、压力分布不均也是引起溃疡发生的重要因素。国内学者的研究集中于皮肤层次,国外学者除皮肤层次外,还对SD糖尿病大鼠的股薄肌持续施以2h的恒定压力,处死后测量股薄肌的正切模量,通过采集模型数据建立足底组织有限元(FE)分析模型。该模型是研究糖尿病足足底骨突部位压力分布异常对组织萎缩和局部溃疡影响的有效模型。此研究在动物模型基础上采集数据建立有限元分析模型的方法,或许在建立糖尿病足实验动物模型评价标准方面有潜在应用价值。因糖尿病足神经病变导致的皮肤温度觉障碍,所以烫伤成为造成临床糖尿病足患者足部损伤的常见原因。有学者采用恒温水浴槽烫伤法建立糖尿病足大鼠模型,STZ诱导大鼠糖尿病后饲养8周,将大鼠背部通过自制烫伤板置于80℃的水中5s,制备体表深Ⅱ度烫伤模型。该方法模拟了糖尿病足溃疡渗出、红肿体征明显,不足之处造成的烫伤面积形状不规则,不便测量。刘坡等使用恒温恒压电热烫伤仪制作糖尿病大鼠不同深度烫伤模型,采取固定压力、温度,设置不同时间组的方法制作糖尿病大鼠浅Ⅱ度、深Ⅱ度和Ⅲ度等不同深度皮肤烫伤模型。该方法操作简单、重复性高,其中深Ⅱ度烫伤溃疡较皮肤直接切除愈合时间长,是研究糖尿病足创面延迟愈合较为理想的模型。4糖尿病足的临床模型糖尿病足是糖尿病患者发病高、负担重的严重并发症。尽管实验动物在侧支血管开放时间、溃疡愈合时间、皮肤紧张度等方面,与模拟人类慢性溃疡的特性方面有物种差异,但在动物整体水平建立模拟糖尿病足的疾病模型,仍是探讨糖尿病足发病机制及药效评价等医学研究的必要手段。糖尿病足模型的糖尿病的建立基本采用STZ诱导的方法,组织破坏方法有对疾病病因的模拟和疾病症状的模拟,目前尚无公认的标准模型。就糖尿病足实验动物模型研究进展小结如下。第一,糖尿病足实验动物的选取,目前多选用大鼠作为机制和药效研究对象,犬为血管介入研究的首选。第二,糖尿病足实验动物模型的建立根据疾病发生可分为糖尿病建立阶段和组织破坏阶段。糖尿病建立阶段,采用STZ诱导或选用NOD、db小鼠。其中长期高脂饲料喂养结合STZ诱导的糖尿病模型与人类2型糖尿病较为相似。在溃疡模型建立阶段,单一因素缺血性实验动物模型,无论是采用动脉结扎/切除法、降温/冷冻法,还是皮肤压迫法,对缺血性溃疡的模拟都不理想。感染性动物模型中,采取后肢足底注射菌悬液的方法,选择单种菌株注射便于试验分析,混合感染则更符合临床实际。糖尿病足的发生是血管病变、神经病变、感染和其他多种致病因素综合作用的结果。多因素复合糖尿病足实验动物模型较单一因素模型在机制和症状表现上更为相似。多因素的复合组合方法较多,有免疫抑制复合动脉破坏或皮肤感染,动脉破坏复合皮肤损伤,血管粥样硬化复合皮肤破坏。目前并没有明确的证据证明何种组合最为理想,但鉴于糖尿病足感染的高发生率,感染因素是复合因素模型建立必须要考虑的。第三,在糖尿病足的研究中,西方学者采用的动物模型多模拟缺血、神经病变、感染性的发病因素或压力异常等高危因素,其模型症状表现可能与临床常见的糖尿病足相差较远,或者直接造成皮肤破坏单纯模拟症状,将二者结合的研究较少。中医药学者采用的糖尿病足模型与中医对糖尿病足的认识有关,起初以脱疽分型研究为主,模拟临床缺血的症状,但对病因的模拟不足,模型表现出的病理状态与中医的某个证候并不能等同。近年来随着中医药对病症结合动物模型研究的深入,多因素复合造模受到更多关注,使动物模型既符合中医的致病因素,又符合临床自然的实际过程。越来越多的学者在模型建立方面逐渐注重对多种发病因素如缺血、神经病变、感染的考量和结合实验室指标进行客观评价[11,12,19,35,37,38]。其中多因素分阶段的造模方法既能够满足发病机制的“病”的特征,又具有相对稳定的“证”表现,是中医药研究糖尿病足的较为理想的模型。理想模型的建立需要有相对稳定的组织学、生物化学和分子生物学特征,其