栀子的化学成分及抗白血病活性研究

栀子的化学成分及抗白血病活性研究【摘要】目的阐明栀子GardeniajasminoidesEllis中抗急性淋巴细胞白血病的活性成分。方法用色谱方法分离栀子中化学成分，用波谱技术(IR，ESIMS，1HNMR，13CNMR)进行结构鉴定，用四唑盐(MTT)比色法测定化合物对白血病细胞增殖的影响。结果分离鉴定了8个化合物：β谷甾醇，5羟基7，3′，4′，5′四甲氧基黄酮，熊果酸，D甘露醇，栀子苷，去乙酰车叶草甙酸甲酯，京尼平1β龙胆苷，鸡矢藤次苷甲酯。化合物3对3种白血病细胞增殖均表现出了一定的抑制作用，其中对REH细胞系抑制活性最强，IC50为μg/mL。结论化合物3具有抗急性淋巴细胞白血病的作用。

【关键词】栀子急性淋巴细胞白血病活性成分四唑盐比色法

Abstract:ObjectiveTodeterminetheactiveconstituentsfromGardeniajasminoidesagainstacutelymphoblasticleukemia.MethodsCompoundswereisolatedandpurifiedbyvariouscolumnchromatographictechniquesandthrstructureswereelucidatedonthebasisofspectralanalysis(IR,ESIMS,1HNMR,13CNMR).TheinhibitoryactivityagainsttheproliferationofHL60,REHandRajicelllineswasdeterminedbyusingMTTassay．Resultsghtcompoundswereisolatedandidentifiedasβsitosterol(1)，5hydroxy7，3′，4′，5′tetramethoxyflavone(2)，Ursolicacid(3),Dmannitol(4)，geniposide(5),deacetylasperulosidicacidmethylester(6),genipin1βgentiobioside(7)andscandosidemethylester(8).Compound3exhibitedinhibitoryeffectsonleukemiccellproliferationinvitrowithIC50of,andμg/mLaginstHL60,REHandRajicelllines,respectively．ConclusionUrsolicacidmightbeoneoftheactiveingredientsagainstanti-acutelymphoblasticleukemiaconferredbyGardeniajasminoidesEllis.

Keywords:GardeniajasminoidesEllis；acutelymphoblasticleukemia；activeconstituents；MTTassay

1），5羟基7，3′，4′，5′四甲氧基黄酮，熊果酸，D甘露醇，栀子苷，去乙酰车叶草甙酸甲酯，京尼平1β龙胆苷，鸡矢藤次苷甲酯，其中熊果酸对白血病细胞增殖表现较强的抑制作用。

1仪器与材料

FisherJohns熔点仪，SHIMADZUFTIR8400S红外光谱仪，BrukerAM500型核磁共振仪，ThermoScientificLTQOrbitrap质谱仪，上海亚荣旋转蒸发仪RE2000，SpectraMax190酶标仪(美国MolecularDevices公司)，薄层板和硅胶，SephadexLH20为Pharmacia产品，其他试剂均为分析纯。

细胞株：HL60人早幼粒细胞白血病、REH人急性淋巴细胞白血病、Raji淋巴瘤

栀子样品于2008年3月购自北京同仁堂京北康大家园药店，经林余霖研究员鉴定为栀子GardeniajasminoidesEllis。植物标本存放于中国医学科学院药用植物研究所标本馆，编号为R001。

2方法

2．1提取与分离

焦栀子经过粉碎，用体积分数95%乙醇回流提取3次，每次2h，提取液减压浓缩得浸膏100g，称取硅胶(100～200目)210g拌样，上硅胶色谱柱,用三氯甲烷甲醇洗脱：三氯甲烷甲醇洗脱部分可得到化合物1、化合物2、化合物3；三氯甲烷甲醇洗脱得化合物5、化合物6、化合物7；三氯甲烷甲醇洗脱得到化合物8；三氯甲烷甲醇洗脱得到化合物4。

活性筛选

粗提物、各组分及化合物以二甲基亚砜溶解，配成50mg·mL-1的储备液，-20℃保存。临用时用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液稀释，配制所需浓度。取对数生长期的肿瘤细胞2×105个/mL，接种于96孔培养板,每孔100μL,设不同浓度的细胞组、空白对照组、调零组，至终体积为200μL，每组设6个复孔。接种后，于37℃、5%CO2中进行培养。培养48h后，每孔加入MTT20μL，孵育4h后，1000r/min离心5min,小心吸弃培养液，加入DMSO150μL，振荡10min，充分溶解MTT。酶标仪测定各孔吸光度，其中测定波长为570nm，校正波长为650nm。计算生长抑制率。

生长抑制率=给药组A值-调零组A值细胞空白对照组A值-调零组A值×100%

3结果与讨论

3．1结构鉴定

化合物1:无色片状晶体，mp142～143℃。MSm/z：414(M+)，与文献［3］报道数据一致；与对照品β谷甾醇共薄层层析，两者的Rf值、斑点颜色完全一致。鉴定为β谷甾醇。

化合物2:无色针晶(石油醚)，1HNMR(500MHz，CDCl3)δ：［6H，s，(CH3)2C3′,C5′OCH3］，(3H，s，C7OCH3)，(3H，s，C4′OCH3),(1H，d，C8H)，(1H，d，C6H)，(1H，brs，C3H)，(2H，s，C2′H，C6′H)，(1H，brs，C5OH)。以上数据与文献［4］报道一致，确定为5羟基7，3′，4′，5′四甲氧基黄酮。

化合物3:白色结晶，mp269～270℃。13CNMR(DMSOd6)δ:(C1)，(C2)，(C3)，(C4)，(C5)，(C6)，(C7)，(C8)，(C9)，(C10)，(C11)，(C12)，(C13)，(C14)，(C15)，(C16)，(C17)，(C18)，(C19)，(C20)，(C21)，(C22)，(C23)，(C24)，(C25)，(C26)，(C27)，(C28)，(C29)，(C30)。上述数据与文献［5］报道一致，与标准品进行薄层层析对照，Rf值一致，鉴定为熊果酸。

化合物4:无色针状结晶，mp167℃。ESIMSm/z：181［MH］-。IR(KBr)cm-1：3260，2940，

1470，1105，1030。以上数据与文献［6］报道一致。13CNMR(DMSOd6)δ：(C2,5)，(C3,4)，(C1,6),综上所述鉴定为D甘露醇。

化合物5:白色粉末(三氯甲烷)，mp163～164℃。ESIMSm/z：411［M+Na］+。1HNMR(500MHz，DMSOd6)δ：(1H，s，H3)，(1H，brs，H7)，(1H，d，J=，H1)，(3H，s，COOCH3),(q，2H，H10a，10b)。以上数据与文献［4］报道一致，确定为栀子苷。

化合物6:无色粉末。ESIMSm/z：427(M++Na)，1HNMR(500MHz，DMSOd6)δ：(s，H3)，(s，H7)，(d，J=Hz,H1)，(d，J=8Hz，H1′)，(q，2H，H10a，10b)，～(m,4H，H2′，4′，3′，5′)。以上数据与文献［6,8］报道基本一致，鉴定为去乙酰车叶草苷酸甲酯。

化合物7:无色粉末。ESIMSm/z：573(M++Na)，1HNMR(500MHz，DMSOd6)δ：(s，H3)，(s，H7)，(d,J=Hz,H1),(d，J=7Hz，H1′)，(q，2H，H10a，10b)。以上数据与文献［7］报道基本一致，鉴定为京尼平1β龙胆苷。

化合物8:无色粉末。1HNMR(500MHz，DMSOd6)δ：(s，H3)，(s，H7)，(d，H1)，(d，J=8Hz，H1′)，(q，2H，H10a，10b)，～(m,4H，H2′，4′，3′，5′)。以上数据与文献［6,8］报道基本一致，鉴定为鸡矢藤次苷甲酯。

活性筛选结果

活性筛选结果显示，化合物3(熊果酸)对3种白血病细胞增殖均表现出了一定的抑制作用，其中对REH细胞系抑制活性最强，IC50为μg/mL。

表1化合物对3种白血病细胞增殖的抑制作用

Table1IC50(50%Inhibitoryconcentration)ofcompoundsfromGardeniajasminoidesEllisagainstthreedifferentleukemiccelllinesIC50/

有关熊果酸对急性淋巴细胞白血病细胞的抑制作用此前未见文献报道。本文结果表明，栀子提取物中抑制细胞增殖的活性成分主要在低极性部位，水溶性部分没有显示细胞抑制作用。在分离的得到的化合物中，三萜类成分熊果酸显示出了较强的体外活性，对3种白血病细胞均有一定的抑制作用，尤其对急性淋巴细胞白血病REH细胞株有较强的抑制作用；而其他化合物均没有细胞抑制作用。

民间治疗急性淋巴细胞白血病通常是取30～40个焦栀子加水煎汤。30～40个栀子大约25～35g，熊果酸在栀子中的质量分数约为%～%［9］，相当于约100mg左右熊果酸的用量，这一用量可在体内一定程度上达到抑制白血病细胞增殖的起效剂量。因此，熊果酸可能为栀子治疗急性淋巴细胞白血病的一个活性成分。当然，栀子中其他成分在治疗急性淋巴细胞白血病中发挥的作用及其机制可能也不可忽略，例如虽然本文中水溶性部分没有显示直接的抑制白血病细胞增殖的活性，但文献研究发现栀子多糖具有比较广谱的体内抑瘤效应［11-12］，栀子中环烯醚萜有机酸酯类成分具有抗氧化和抗炎活性［12］，这些活性作用可能对急性淋巴细胞白血病的治疗也发挥一定的辅助作用。

【参考文献】

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［M］．北京：化学工业出版社，2005：173.

［2］贾堃．中医癌瘤学［M］．西安：陕西科学技术出版社，1996：374.

［3］国家医药局中草药情报中心站．植物药有效成分手册［M］．北京：人民卫生出版社，1986：968.

［4］陈红，肖永庆，李丽,等．栀子化学成分研究［J］．中国中药杂志,2007,32(11)：1041.

［5］斯建勇，陈迪华，潘瑞乐,等．白花蛇舌草的化学成分研究［J］．天然产物研究与开发,2006,18(6)：942.

［6］王钢力，赵淑杰，陈德昌．大黄栀子果实化学成分的研究［J］．中国中药杂志1999,24(1)：38.

［7］李霄，石任兵，刘斌,等．清脑宣窍方有效部位的化学成分研究［J］．北京中医药大学学报,2005,28(2)：70.

［8］苏保宁，贾忠建．利用波谱技术确定环烯醚甙的结构［J］．兰州大学学报：自然科学版,