乙酰丁香酮在农杆菌遗传转化中的应用

乙酰丁香酮在农杆菌遗传转化中的应用

作为一种自然植物遗传转化体系，农杆菌的遗传转化具有转化外源dna结构完整、转化机制清晰、整合位点稳定、破碎率低、融合后外源遗传结构变化小等优点。已成为植物转世策略的首选，建立高效的遗传转化体系已成为一个非常重要的研究领域。研究证明,宿主植物细胞能分泌某些酚类化合物,可诱发农杆菌内Ti或Ri质粒DNA上Vir区基因的活化和高效表达,促进农杆菌T-DNA向宿主细胞核转移,从而提高遗传转化效率。其中常用且诱导效果最佳的是乙酰丁香酮(AS),由Stachel等从代谢活跃的烟草根、叶愈伤组织的提取物中分离得到。近年来,AS被广泛应用于植物遗传转化中,取得了较好的效果,使得农杆菌介导的遗传转化方法更加完善。笔者简要综述了AS提高植物遗传转化率的作用机理、影响因素及其应用,并提出了自己的一些见解,为提高AS在遗传转化中的使用效率提供一些参考。1as诱导酚类化合物作用机理植物和微生物可以通过一些化学物质分子,以化学的方式发生相互作用。早在1984年,Shaw等的试验表明,农杆菌对酚类化合物具有趋化性,而且这种趋化性依赖于virA和virG基因。Stachel等发现烟草叶子的受伤部分比非受伤叶子具有明显的诱导作用,并从受伤植物细胞中分离提取出了AS,将其作为趋化物来识别。近年来,随着研究的深入,AS的作用机理也越来越清楚,为AS在遗传转化中的应用和遗传转化率的提高奠定了基础。AS作为诱导性最好的酚类化合物,其作用机理主要是通过诱导农杆菌Vir区基因的活化与表达,促进T-DNA的加工与转移,从而使农杆菌T-DNA更易进入植物基因组并与其整合。农杆菌Ti或Ri质粒的Vir区编码产物负责接收外界信号、T-DNA的加工、转移及整合等功能,对菌种的侵染力起决定性的作用。农杆菌在生长培养基中培养繁殖时,所有的Vir区基因均处于非转录活性状态,这些基因接受AS等信号分子后便开始转录活化。virA编码一种结合在膜上的化学受体蛋白,其蛋白的胞质区有自激酶的功能,可自我催化使其474位保守的组氨酸残基磷酸化,virA蛋白从而被激活。磷酸化的virA蛋白进而将其磷酸基转移到virG保守的天冬氨酸残基上,使virG蛋白活化,活化的virG蛋白以二体或多体的形式结合到其他Vir区基因启动子的特定区域,从而激活其他vir基因的转录,产生T-DNA切割、包装、转移所需的功能蛋白。酚类化合物的诱导效果与其分子结构有很大关系,这也是AS诱导效果最强的原因。对与AS相近的一些化合物的检验表明,苯环上3、52个位置上的碳原子都结合甲氧基的化合物比只含1个甲氧基的化合物具有更强的诱导性。Melchers等进一步研究了大量的与AS相近的化合物,发现这些化合物均遵守一个化学“规则”,即通常情况下,最强的诱导物在其苯环上含有一个愈创木脂或丁香酮取代基,还有一个羟基电子群。AS的分子结构见图1。2影响as效果的因素遗传转化是多因素调控、非常复杂的体系,AS作为一种诱导Vir区基因活化的物质,在使用过程中会受到多种因素的影响。2.1补充as与农杆菌AS是常用的诱导性最强的酚类化合物,虽然被广泛用来提高遗传转化率,但在不同植物种类上应用效果不同。AS是双子叶植物细胞壁合成的前体,一般认为细胞渗出液中含有0.5~1.0μmol/L的AS即可诱导农杆菌Vir区基因活化,但最适诱导浓度要更高。因此,大多双子叶植物的遗传转化仍需补充AS以提高转化率,也有少数双子叶植物在受伤的组织中可以产生一些酚类物质,这些酚类物质已能起到活化vir基因的作用,所以在遗传转化中加入AS转化效率并没有明显提高。单子叶植物对农杆菌的敏感性一般要比双子叶植物差,转化较困难,但最近大量的研究表明,部分单子叶植物在转化时使用AS能使转化率明显提高。以前认为根癌农杆菌不易感染单子叶植物,是因为农杆菌不能吸附到植物细胞的表面,或者是由于单子叶植物细胞中生长素和细胞分裂素平衡异常。但Graves等的扫描电镜观察表明,农杆菌能够以在双子叶植物中相同的方式结合到单子叶植物细胞的表面。所以农杆菌被认为不能转化单子叶植物的原因,可能是转化频率太低,或者是单子叶植物内缺乏足够数量的信号分子。现在发现,在某些单子叶植物中也能产生酚类化合物,如玉米、斑心吊兰、山药和唐菖蒲等,这些单子叶植物都能被农杆菌感染。而对于一些不易被农杆菌感染的植物,如果在转化过程中加入AS等酚类化合物,也有可能被农杆菌感染。2.2as的浓度AS难溶于水,需使用溶剂才能溶解。一般用于拟蓝芥花侵染的,配制使用的溶剂为DMSO;用于愈伤组织侵染的,则用少量甲醇溶解后再用蒸馏水定容。AS的贮存液需过滤灭菌,并且在培养基温度小于60℃时加入。在众多研究中,AS的有效使用浓度一般在50~200μmol/L,浓度太高则会影响转化效率,或对外植体产生毒害作用。Mohri等在日本白桦的转化中报道,加入AS100μmol/L可使转化率提高8倍。张天宇等在苜蓿转化过程中向农杆菌液体培养基及共培养基中都加入10mg/L的AS时,GUS阳性率、抗性愈伤率和抗性芽再生率均高于其他处理,但当AS浓度大于20mg/L时则抑制转化。席梦利在研究杉木转基因时发现,共培养基中添加AS浓度为80μmol/L时,Km抗性芽的产生频率比对照有了明显提高,而AS浓度为160、320μmol/L时,茎段褐化速度加快,这可能是AS对茎段产生了毒害作用。2.3as在遗传转化中的作用AS通过诱导农杆菌基因组中vir基因的活化,激活毒性区上其他基因的表达,使T-DNA成功导入,提高转化频率。目前,在遗传转化中对AS使用较多的方式为在菌液、共培养基以及在菌液和共培养基中共同加入。一般农杆菌附着16h后才进行转化,AS的加入可缩短共培养的时间,因此,许多科学家赞成在共培养基中加入。当然,也有很多研究采用其他的方法来加入AS,部分方法也起到了较好的效果。James等的研究结果表明,在苹果愈伤组织周围滴加适当浓度的AS,抗性愈伤组织的获得率可提高到80.0%。杨秀荣等在甘薯遗传转化研究中得出,在外植体切口处滴加2μl200μmol/LAS后,可使得Kanr芽获得率由7.6%提高到13.3%。郑树松等在预培养和共培养时添加AS可以显著提高棉花下胚轴的抗性愈伤组织的诱导率,而在摇菌时添加AS会降低抗性愈伤组织的诱导率。邓君萍将麻疯树子叶在分化培养基上预培养2d,并在预培养基和离心后的MS0农杆菌菌液中加入AS,最后得到的瞬时表达效率较高(60%)。魏爱民等在菌液、共培养基、菌液和共培养基中加入AS,愈伤诱导率均高于95%,但他尝试在播种培养基中加入AS,试图通过调整外植体内源T-DNA诱导物水平,研究其对抗性芽分化的影响,试验结果表明愈伤诱导率、芽分化率均较低,与对照差异不明显,说明在种子萌发培养基中加入AS对芽诱导的作用较小。2.4外植体的外生物测定和菌株对菌株作用的影响农杆菌的侵染能力对不同植物有着很大差异,菌株及载体类型作为植物遗传转化中的关键因子之一,对AS的诱导作用也会产生很大的影响。如窄宿主范围的Ti质粒pTiAg162仅能在葡萄的几个品种上诱发肿瘤,它的virA基因产物不能应答AS的诱导,从而影响其他vir基因的活化。Huang等的研究指出,菌株及载体类型可影响AS的作用效果。杨秀荣等在菌液中加入AS并不能提高甘薯茎段外植体Kanr芽获得率,推测这可能与所用的菌株和试验材料不同有关,其所用的菌株为N9-1,极易受AS的激活而过度繁殖,致使农杆菌对外植体造成伤害,进而影响了其不定芽的分化。高秀清等研究了4种发根农杆菌对茶树外植体转化效率的影响,得出15834是对“龙井43”品系最有效的菌株,诱导率达18.9%,添加AS后诱导率增至48%,但是否适合其他茶树品系还需试验确定。2.5培养基ph值对甘薯转化的影响pH值对Vir区的活化有着明显的影响,从理论上讲,含AS的培养基pH值为5.0~5.6时,Vir区基因的诱导达到最高水平。章鱼碱型和农杆碱型菌系比胭脂碱型和琥珀碱型需要更低pH值。Holford等研究表明,AS的诱导效果与培养基的pH值有关,pH值为5.2时转化效果最好。杨秀荣等在研究中发现,在培养基pH值为5.8时,加入AS对转化的效果影响不显著,而将pH值调至5.2后,加入AS可明显促进甘薯的遗传转化。此外,在毕瑞明等、郝贵霞等、凌键等的研究中也有类似报道,认为AS的存在及较低的pH值环境,可能使农杆菌及其内含的质粒产生一系列反应,诱导并激活Vir区基因,使其表达,从而导致了转化事件的发生,提高转化效率。2.6as与gus基因表达的协同作用Veluthambi等报道,在农杆菌侵染时用AS或AS+nopaline处理棉花受伤的顶端分生组织,提高了转化效率。James等在苹果叶片转化中同时加AS及渗透稳定剂甜菜碱或脯氨酸,促进了GUS基因的表达。说明这些物质可能和AS有协同促进Vir区基因活化的作用,从而使转化率得到提高。赵东利等为了解AS和超声波处理在提高转化率方面是否存在协同作用,将子叶和下胚轴外植体浸入到含一定量(终浓度为100μmol/L)AS的发根农杆菌诱导液中后,超声波处理2min。结果表明,AS的存在可使子叶和下胚轴的转化率在原来的基础上又分别提高了近10%和7%,表明二者在提高发根农杆菌对苦豆子的转化率方面具有明显的协同作用。此外,低磷酸盐和合适的碳源有利于T-DNA的转移,这些因素都会对AS的作用产生影响。3农杆菌t-dna的代谢转化近年来,AS因其较强的诱导性,被广泛用于多数双子叶植物、少数单子叶植物甚至是裸子植物的遗传转化中,已使许多植物如毛白杨、棉花、苹果、大豆、小麦、甘薯、烟草、玉米、番茄等的转化率得到了提高,为优化遗传转化体系提供了一个方向。Bolton等和Stachel等对根癌农杆菌质粒转化机制的研究表明,受AS等植物信号因子激活的Vir区基因的活化和高效表达是农杆菌T-DNA以Ti质粒向宿主细胞核中转移所必需的,并能提高根癌农杆菌对宿主的转化率和敏感性。Sheikholeslam等在农杆菌转化拟南芥的试验中使用AS,使转化率从2%~3%提高到55%~63%。Owens等在农杆菌菌液中添加AS,使大豆的转化效率得到了提高。后来,有研究者用20~100μmol/LAS或双子叶植物(如烟草、马铃薯)的伤流液处理农杆菌或培养基,也使猕猴桃及苹果等的转化率得到了提高。在国内,对AS的研究应用稍晚,最早是许耀等的相关报道。早期应用方面,邓万银等在大麦、小麦和鸭跖草的遗传转化中研究发现,AS能同时提高肿瘤诱导频率和冠瘿瘤的直径,并在另一种单子叶植物斑心吊兰上的试验也得到了类似的结果。最近,王捷深研究新疆杨转基因时发现,在共培养基中添加AS,Km抗性芽的产生频率比对照高了近4倍。高秀清等将发根农杆菌15834与茶树外植体共培养后,分别转入含有AS(300mg/L)和不含AS的培养基中培养,结果发现AS对茶树叶片毛状根的产生具有明显的促进作用。魏爱民等在黄瓜转基因研究中发现,在菌液和共培养基中同时使用AS,抗性芽分化率最高。4与其他酚类化合物配合使用近年来,AS在植物遗传转化中的应用越来越多,使大多数植物的遗传转化率得到了提高。但在众多应用研究中,研究人员往往采用传统的模式,缺乏创新,达不到最好的效果。笔者结合前人的研究,提出了自己的建议。(1)virA基因和AS之间的相互作用方式还未完全清楚,有待深入研究。Stefan等曾报道过AS受体区域分布在virA蛋白的第283~304氨基酸区段之间的细胞质区域内,但是对virA基因和AS之间的相互作用是直接的还是需要其他酚类结合蛋白还不是十分清楚,也未见相关的后续报道,这一点有待深入研究。(2)复合酚类化合物比单一酚类物质的诱导效果更好,可以将AS和其他酚类化合物进行配合使用。许耀等认为复合酚类化合物的预处理比单一酚类物质的预处理效果更为明显,表明前者能够同时诱导Vir区多个转录位点的活化。王关林等也认为当各种诱导物同时存在时,其效应要比单个诱导物的作用大得多。因此,可以考虑将AS和其他酚类化合物进行配合使用,以期达到更好的诱导效果。(3)农杆菌介导的遗传转化过程受多种因素控制,使用AS时要综合考虑这些因素的影响。农杆菌介导的遗传转化过程是农杆菌、受体植物与外界环境条件共同作用的过程,因此,在使用AS时要综合考虑其他因素的影响。另外,在有些试验中,使用超声波或一些辅助物质(如甜菜碱、脯氨酸等)能和AS产生协同作用,有利于外植体的遗传转化。随着技术的发展和研究的深入,还可以试验更多相关的新技术和新物质,使AS在遗传转化中发挥更好的作用。(4)AS在单子叶植物中应用的相关机理还不是很明确,有待进一步研究。近几年的研究表明,许多单子叶植物是能够被转化的,但转化的机理还不是很明确。邓万银等认为农杆菌难转化单子叶植物的原因是转化频率太低,或是单子叶植物缺乏足够数量的信号分子;但许东晖等在1996年对水稻信号分子的分离和确定的研究中提出,单子叶植物不能被转化不是由于其缺少信号分子,而是由于这类信号分子仅在植物特定发育时期的特定部位产生。也有人认为在某些转化中即使补充了AS,很多