五子衍宗丸和金匮肾气丸促进无精子症模型小鼠生精能力恢复的全基因表达谱比较

五子衍宗丸和金匮肾气丸促进无精子症模型小鼠生精能力恢复的全基因表达谱比较

使用基因芯片技术研究中细胞基因的功能机制是近年来的一种有效方法。由于在机体200余种细胞中只有生精细胞在成熟过程中因细胞质脱逸丧失了DNA损伤与修复系统的特性,决定了其对各种毒害物质最为敏感且发生的突变更容易具有累积效应。人类精液质量随着环境质量的变化呈现普遍下降的趋势引起关注[4~7]。在治疗精液质量异常导致男性不育时中医中药具有特殊优势。五子衍宗和金匮肾气是中医男科精华中的经典名方,临床上大量有效方剂多以此为基础化裁形成。在前期实验中发现,上述两种中药对生精作用具有不同表现,作用机理也存在明显不同。为深入了解其中药基因水平的分子表现和作用靶点,本课题利用基因芯片技术进行了研究。1材料和方法1.1试剂和试剂盒五子衍宗丸(批号4030124)、金匮肾气丸(批号5033595)均为北京同仁堂产品;白消安为Sigma公司产品;二甲基亚砜(DMSO)为Axygen公司产品;TRIZOL试剂为Invitrogen公司产品;AmbionMessageAmpaRNA扩增试剂盒为Ambion公司产品;NucAway柱为Ambion公司产品;无RNA酶的糖原为Invitrogen公司产品。1.2小鼠单次注射白消安造模选择无特定病原菌(SPF级,三级动物)成年12周龄NIH雄性小鼠82只,常规饲养。无精子症动物模型按照白消安诱导常规方法造模,白消安溶解于DMSO中配制成2%药液,68只小鼠单次腹腔内注射给药(40mg/kg),第2天开始出现死亡,观察6周,陆续死亡25只,死亡率36.8%。白消安造模存活小鼠分为五子衍宗丸组16只、金匮肾气丸组17只,按照人临床5倍剂量换算,分别给予五子衍宗丸纯净水悬液(0.048g/d/只)、金匮肾气丸纯净水悬液(0.04g/d/只)。2组连续给药78d(2个小鼠生精周期)。正常对照组14只给予纯净水。1.3侧睾丸和附睾丸所有动物最后一次给药24h后,断脊处理,取出双侧睾丸和附睾,一侧的睾丸和附睾固定于Bouin液中,常规切片;另一侧睾丸,迅速液氮冷冻后,于-70℃冰箱中保存,用于睾丸全基因表达谱研究。1.4检测大鼠睾丸中的基因表达检测采用Phalax公司的MouseOneArray芯片,该芯片以MouseExonicEvidenceBasedOligonucleotide(MEEBO)设计为基础,每芯片上有29922个小鼠基因探针和1800个实验探针。按照TRIZOL试剂使用说明书提取睾丸组织总RNA,变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,反转录合成cDNA第1链、第2链。以双链的cDNA为模板,体外转录反应合成反义RNA(aRNA)。aRNA经过纯化后,用aa-UTP对其进行间接Cy3单荧光标记。经过和芯片预杂交、杂交和洗片后对结果扫描,数据读取。1.5差异基因基因筛选的数据分析以2组间上调或下调>2倍为有意义的差异基因。差异基因分析、芯片数据的统计学分析、聚类分析采用MouseOneArrayAnnotationMOA2release2.0软件。2结果2.1睾丸全基因表达谱的测试随机选择正常对照组和五子衍宗丸组、金匮肾气丸实验组各5只动物单侧睾丸组织,进行睾丸全基因表达谱的测试分析。实验组睾丸组织总RNA抽提电泳结果显示其18S和28S条带均清晰,说明RNA的纯度达到实验设计要求。2.2各组表达的基因通过计算机扫描和定量分析,在31722个基因中,检测表达在2倍、4倍、≥6倍明显差异的基因。与正常对照组比较,五子衍宗丸组以基因下调为主,金匮肾气丸组以基因上调为主;五子衍宗丸组和金匮肾气丸组比较以基因下调为主,见表1。2.3这两个中药组和正常对照组之间的基因显著增加两中药组与正常对照组比较共同上调≥2倍的基因32个,表达产物的功能以蛋白合成和嗅觉受体基因为主,见表2。2.4中药组和正常对照组的两个共同基因降低两中药组与正常对照组比较共同下调≥2倍的基因12个,表达产物的功能以结构蛋白的代谢为主,见表3。2.5五子衍宗丸组与金九肾丸组的比较有所增加2.6五子衍宗丸组与金九肾丸组的比较由表1可以看出差异表达为2~倍、4~倍、≥6倍下调基因分别为424个、55个、22个,下调基因分析见表6,基因功能分类见表7。2.7表达基因表达对基因表达谱的数据利用KEGG进行Pathway分析,显示差异表达基因主要在脂肪细胞因子信号通路、细胞周期、MAPK信号通路、Wnt信号通路、Notch信号通路、Ecm受体作用、Jak-Stat信号通路、细胞因子-细胞因子受体作用等8个信号通路方面。3金保持生精细胞增殖随着分子生物学技术的不断发展,筛选差别表达基因的方法亦取得了很大进展:基因芯片技术的出现为同时检测生物体基因mRNA水平整体表达提供了强大的支持,为揭示中药的分子作用机理和分子靶点提供新的有效手段。对经典补肾生精方药的基础研究长期欠缺,但是现有的报告可以提供基本研究思路。五子衍宗丸对小鼠无精子症模型动物的生精能力具有明显诱导分化和促进恢复作用,可以增加去势大鼠附性腺重量和血清睾酮,明显升高血清NO和超氧化物歧化酶,对大鼠少精子症模型动物具有明显提高精子数目和活动率,降低畸形率的作用。金匮肾气丸对小鼠无精子症模型动物的生精能力具有明显促进恢复作用。五子衍宗丸和金匮肾气丸在对无精子症模型小鼠的生精作用明显不同,五子衍宗丸对生精干细胞的刺激作用更明显,能显著提高生精细胞的数量;而金匮肾气丸在刺激生精干细胞同时,对支持细胞的保护作用明显强于五子衍宗丸。本研究表明,与正常对照组比较,五子衍宗丸以下调基因为主,金匮肾气丸以上调基因为主;五子衍宗丸和金匮肾气丸比较也以基因下调为主。两种中药可以共同上调32个基因,共同下调12个基因,说明其在诱导和分化生精干细胞、促进生精过程中基因水平的协同性和差异性。精子发生是一个独特复杂的细胞分化过程,受到多因素的调控,其中生精细胞内的基因调节起着决定作用。在服用金匮肾气丸的小鼠睾丸组织中,lrp8的表达高于服用五子衍宗丸小鼠,lrp基因编码的低密度脂蛋白受体相关蛋白广泛存在于多种组织,可以介导细胞的内吞作用,参与到脂蛋白代谢和蛋白酶降解等生理生化过程中,还能参与脉管系统保护和细胞迁移调控等重要生理过程。服用五子衍宗丸后,小鼠的matn2基因上调明显。由matn2编码的Matrilin是非胶原型细胞外基质蛋白的新家族成员之一,广泛分布于多种组织中,可能参与多种组织的重塑作用,陈中等认为在肝卵圆细胞可以产生Matrilin2,促进肝细胞的分化。白消安致无精子症模型小鼠服用五子衍宗丸后比服用金匮肾气丸后该基因的表达明显上调,提示睾丸中的相关细胞可能通过细胞与细胞外基质的相互作用参与到睾丸细胞生精能力的恢复过程中。与金匮肾气丸相比,服用五子衍宗丸后非特异免疫相关信号途径中的基因如:MKK4/7、MKK3/6、IL-3、TNF-α和P38等明显上调,而趋化因子途径的相关基因如:JAK、Stat、NFκB和IκB等基因明显下调。因此,五子衍宗丸在增强免疫功能的同时抑制了趋化因子信号通路凋亡相关的一些基因的表达,使无精子小鼠免疫力增强,生精能力恢复。而与五子衍宗丸相比,在服用金匮肾气丸的小鼠中,与细胞增殖相关的多个信号途径全面启动,对生精细胞的增殖有明显的促进作用。综上所述,两种经典补肾中药均具有较强