植物生长调节剂对微型月亮rosahybrida的诱导

植物生长调节剂对微型月亮rosahybrida的诱导

小型玫瑰是玫瑰家族的新品种。这是蔷薇科属多年生树木的一种多年生灌木，有落叶或半叶落。其株型矮小、花头众多且花色奇异,全年均开放,适合于盆栽。因其品性独特又被称为“钻石月季”,花瓣可用于提取香料。据报道,早在1996年产于丹麦的微型月季已高达3500万株(Mülleretal.,1998)。可见微型月季在园林绿化中具有不可或缺的价值。近年关于微型月季的快速繁殖和栽培已有一些研究和报道。其中沈国正(2006)以6个盆栽微型月季品种为实验材料进行离体培养,以诱导腋芽增殖为繁殖途径获得了微型月季的再生植株。于冰沁(2005)和刘义存(2007)利用带芽(腋芽)茎段为外植体直接进行离体培养,建立了微型月季的快速繁殖体系,但繁殖频率较低。由于微型月季本身比较矮小,利用常规扦插或嫁接等方法繁殖速度慢,繁殖系数低,成本高,难以大规模应用(宗树斌,2010)。因此,建立高效、稳定且可用于遗传改良的微型月季离体再生体系具有重要意义。本实验以黄色新品种微型月季为研究对象,探讨不同外植体对愈伤组织诱导的影响,以及不同配比的植物生长调节剂对愈伤组织诱导、不定芽诱导和生根的影响,建立了高频离体再生体系,以期为微型月季的遗传改良奠定基础。1植物材料1.1ybridaol.供试材料为微型月季(RosahybridaL.)。将植物材料培养于西北大学生命科学学院人工气候室,经鉴定为新品种黄色微型月季。1.2灭菌2–3取微型月季枝条在自来水下冲洗干净,用75%乙醇表面消毒30–40秒,再用0.1%HgCl2溶液灭菌2–6分钟,无菌水冲洗3–5次。在无菌条件下将叶片、叶柄和茎段剪成0.5cm见方的小块或1cm的小段,并露出新鲜伤口。2培训的组成和条件2.1培养基的制备诱导愈伤组织和不定芽均以MS培养基为基础培养基(含30g·L–1蔗糖和7.0g·L–1琼脂,pH5.8–6.2),分别添加不同配比的6-BA、NAA、2,4-D、TDZ,并于121°C高压蒸汽灭菌25分钟。生根培养基分别用MS培养基+NAA、1/2MS培养基+NAA、1/4MS培养基+NAA或者直接用1/4MS基础培养基。培养条件为(25±2)°C,每天16小时光照,光照强度为40μmol·m–2·s–1。2.2观察时间1:3–4周继代1次选取经处理的外植体接种于不同激素配比(表1)的MS培养基上进行愈伤组织诱导。定期观察,3–4周继代1次。统计愈伤组织诱导率,筛选最适愈伤组织诱导培养基。将生长6、9、12、15、21天(不同叶龄)的微型月季叶片接种于最适愈伤组织诱导培养基上,并统计不同叶龄叶片对愈伤组织诱导的影响。2.3愈伤组织的诱导外植体在愈伤组织诱导培养基上培养30天后,挑选长势良好的愈伤组织,接种于附加不同配比植物生长调节剂(表2)的培养基中进行不定芽诱导,并统计愈伤组织分化率。2.4最适生根培养基的确定将高1–2cm且长势良好的再生苗分别移植到含有不同浓度NAA的MS、1/2MS、1/4MS生根培养基上诱导生根,确定最适生根培养基。2.5培养苗、苗的栽植将再生根生长状况良好的微型月季幼苗取出,用流水缓慢地将根部残留的培养基冲洗干净(注意不要伤及根部),移栽至土壤中炼苗1–7天。2.6统计学分析每种植物生长调节剂配比的培养基至少接种3皿材料,每皿接种8–10块。实验重复3次。所得数据均用Origin8.0和Statist6.0进行统计学分析。愈伤组织诱导率和再分化率的计算公式如下:愈伤组织诱导率=(形成愈伤组织的外植体数/接种的外植体总数)×100%愈伤组织再分化率=(分化出不定芽的愈伤组织块数/接种的愈伤组织总块数)×100%3结果与讨论3.1外植体的愈伤组织诱导用叶片、叶柄和茎段为外植体进行愈伤组织诱导,以采用叶片进行诱导效果最好。以6、9、12、15和21天不同叶龄的微型月季叶片为外植体进行愈伤组织诱导,并对愈伤组织诱导情况进行为期4周的观察和统计。实验结果表明,叶龄12天的微型月季叶片为最适外植体,诱导率可达100%。而采用叶龄小于或者大于12天的叶片进行愈伤组织诱导,其诱导效率均呈下降趋势,下降程度与偏离12天叶龄的程度有关,即偏离程度越大,诱导率越低(图1)。3.2-ba和naa对愈伤组织分化的影响2,4-D、NAA和6-BA是植物体细胞胚发生的常用诱导激素。本实验以微型月季幼嫩叶片为外植体,在附加不同配比的2,4-D、NAA和6-BA的愈伤组织诱导培养基上培养,结果见表1。从表1可以看出,6-BA与NAA组合诱导月季幼嫩叶片形成愈伤组织的诱导率较低,而6-BA与2,4-D组合能较好地诱导叶片形成愈伤组织,诱导率均比较高。当6-BA和2,4-D浓度分别达到1.0mg·L–1和3.0mg·L–1时,只需要4–7天便能启动愈伤组织的发生,诱导率高达100%。随着进一步的培养,愈伤组织呈嫩绿色且比较疏松,生长状态较好(图2A)。当培养基中6-BA的浓度为1.0mg·L–1,2,4-D的浓度分别为3.0、4.0和5.0mg·L–1时,随着2,4-D浓度的增高,所诱导出的愈伤组织质地变硬且颜色偏黄,褐化现象愈来愈严重。可能由于2,4-D是一种较强的诱变剂,在胚性愈伤组织的诱导过程中会导致细胞的变异,从而影响分化再生频率(曾泉和徐子勤,2006)。因此对微型月季未分化的愈伤组织进行继代培养,随着继代次数的增加,愈伤组织的分化能力逐渐下降,愈伤组织的颜色和形态也不断恶化,易出现褐化现象。除了不宜用浓度过高的2,4-D,6-BA或NAA的浓度过高也不利于愈伤组织的分化。过高浓度的NAA形成的愈伤组织比较疏松且呈发泡样,质地较软,不利于形成不定芽;6-BA浓度的增大使所形成的愈伤组织致密且含水量低,不利于再分化。本实验结果表明,诱导愈伤组织的最佳培养基为MS培养基附加1.0mg·L–16-BA和3.0mg·L–12,4-D的激素配比。外植体在此激素配比的培养基上培养28天,在显微镜下可观察到所诱导出的愈伤组织颜色偏浅黄且比较透亮,呈圆颗粒状,质地饱满。可将该种类型的愈伤组织转移到分化培养基中进行不定芽的诱导。3.3培养基浓度对愈伤组织生长的影响将状态良好的愈伤组织转接到含不同植物生长调节剂配比的不定芽诱导培养基上。由表2和表3可知,在培养基中加入6-BA和NAA是产生不定芽的关键。同时还发现在含有6-BA和NAA的分化培养基中加入少量(0.02–0.2)mg·L–1TDZ有利于愈伤组织的生长和产生绿色芽点(图2B),但长时间培养容易导致材料褐化。在基础培养基MS中加入不同浓度配比的6-BA、NAA和TDZ,通过多组实验并对愈伤组织的生长状态和诱导率进行了统计(表2)。结果显示,当6-BA的浓度为1.0mg·L–1、NAA的浓度为0.1mg·L–1、TDZ的浓度为0.02mg·L–1时,愈伤组织表面出现绿色芽点,继续培养4–6周后可形成不定芽(图2C–E),诱导率可达92.6%,此为诱导微型月季不定芽生成的最佳培养基。3.4培养基的选择本实验采用不同的生长素浓度配比诱导微型月季幼苗生根。郗笃隽等(2010)的实验表明,在诱导生根时,微型月季品种间差异显著。本实验中采用的激素配比分别为MS+(0.05–0.5)mg·L–1NAA、1/2MS+(0.05–0.5)mg·L–1NAA、1/4MS和1/4MS+(0.05–0.5)mg·L–1NAA。结果表明,再生苗在MS基本培养基上不能生根,出现烧苗现象,导致小苗底部变黑,最后叶片枯黄而死。因此,在诱导月季生根的过程中不宜采用大量元素过高的MS基本培养基,而1/2MS或1/4MS基本培养基附加(0.05–0.5)mg·L–1NAA均有利于微型月季的生根。本实验中获得了最佳生根培养基,即1/4MS附加0.1mg·L–1NAA,幼苗经过15天的培养便能长出根,生根率为100%(图2F,G)。另外,根据刘用生和李友勇(1994)的研究,活性炭对培养基中有害物质具有吸附作用。因此,在诱导生根的过程中加入少量活性炭有利于根的生长。长势良好的无菌苗通过驯化炼苗后,可移入盆中,经过几天的适应均能成活,移栽成活率为100%(图2H)。3.5讨论3.5.1,4-d对愈伤组织的诱导效果不同部位以及不同发育时期的外植体对愈伤组织的诱导有很大的影响,因此也导致实验结果不同。同时,不同品种之间外植体的诱导能力也存在差异。本实验通过对微型月季植株不同部位的外植体进行实验,结果表明,以幼嫩叶片进行愈伤组织诱导效果最好。这是由于外植体自身的生理结构、分化状态以及脱分化能力存在差异造成的(胡选萍等,2008)。除了外植体,不同种类植物生长调节剂的使用也会影响愈伤组织的诱导效果。张雨等(2010)的综述表明,6-BA、NAA、2,4-D和ZT等常被用作诱导愈伤组织的激素,在愈伤组织诱导过程中,加入适量的NAA或2,4-D比单独使用细胞分裂素更易诱导产生愈伤组织。本实验也得到了相同的结果,即单独使用6-BA、NAA或2,4-D只获得了较低的愈伤组织诱导率。另外,使用不同浓度的植物生长调节剂对愈伤组织的诱导效果有重要影响。李克勤等(1991)对陆地棉(Gossypiumhirsutum)、李文静等(2012)对荠菜(Capsellabursa-pastoris)以及陶铭(2001)对组织培养中畸形胚状体及超度含水态苗进行了研究,他们的结果都表明使用过高浓度的2,4-D在后续的培养过程中愈伤组织易褐化,对再生过程产生不利的影响。本实验所得结论与其相一致,表现为附加5.0mg·L–12,4-D比附加3.0mg·L–12,4-D的实验组继代次数少,愈伤组织的褐化程度高;当2,4-D浓度达到5.0mg·L–1时,甚至会出现畸形胚,不能正常发育形成芽,严重影响了体细胞胚再生形成植株的频率。其原因为2,4-D可以同时诱导和抑制体细胞胚的发生(TisseratandMurashige,1997)。因此,为减小高浓度2,4-D产生的抑制效果,在微型月季愈伤组织诱导过程中2,4-D浓度不宜过高。对于多数植物来说,单独使用生长素无法诱导体细胞胚,利用适当配比的细胞分裂素与生长素组合是体细胞胚发生的关键因素(AttreeandFowke,1993;周俊彦和郭扶兴,1996;TokujiandKuriyama,2003)。本实验中通过不同的生长素和细胞分裂素组合诱导愈伤组织的产生,结果表明,6-BA和2,4-D的浓度分别为1.0和3.0mg·L–1是诱导愈伤组织的最佳激素配比,所诱导的胚性愈伤形态正常,增殖速度快。3.5.2表面活性剂的诱导已有的研究表明,6-BA作为一种细胞分裂素,在一定浓度下能够促进大多数植物愈伤组织的继代、分化和再生(BakerandWetzstein,1994)。本实验中,通过6-BA和NAA组合诱导愈伤组织的分化,结果表明,1.0mg·L–16-BA和0.1mg·L–1NAA能促使愈伤组织分化生成不定芽。在愈伤组织分化中起着重要作用的植物激素除了6-BA和NAA外,TDZ的作用也渐为人们所熟知。王关林等(1997)发现TDZ是具有很强细胞分裂素活性的苯基脲衍生物,它对植物芽的增殖、再生和体细胞胚胎发生等有重要作用。康大力等(2012)研究显示TDZ在喜树(Camptothecaacuminata)组织培养过程中可同时发挥生长素和细胞分裂素的作用。陈云凤等(2006)的研究表明,TDZ对保持愈伤组织生长旺盛和植物体细胞胚胎发生具有重要作用,能提高植物的分化率。参照这些结论,本实验在6-BA及NAA分化培养基中添加了适量浓度的TDZ,结果表明TDZ的加入能促进愈伤组织生长和芽点的形成,诱导效率大大提高。这也与姚静雯(2012)在对白背三七(Gynuradivaricata)进行诱导时的结果相同。但是,在实验过程中,发现愈伤组织在添加了TDZ的诱导培养基中长时间培养容易发生褐化,对其后续的培养产生不利影响。其主要原因为TDZ是具有很强细胞分裂素活性的苯基脲衍生物,它对植物芽的增殖和再生、体细胞胚胎发生等有重要的作用(徐华松等,1996),同时对不同种类植物或同一植物的不同品种体细胞胚发生作用不同(Iantchevaetal.,1999)。此外,TDZ还能诱导外植体从愈伤组织形成到体细胞胚胎发生的一系列不同反应,具有生长素和细胞分裂