植物组织培养技术的应用

植物组织培养技术的应用

植物组织培养技术是指对植物器官、组织、细胞和原生质体的植物，在人工制备环境中培养完整植物的方法。植物组织培养的基础是植物细胞的“全能性”和植物的“再生效应”。1902年，德国著名植物学家g.habarlanlct根据细胞学理论大胆提出，高等植物的器官和组织可以分为单个细胞。也就是说，植物体细胞在适当的条件下有持续的分裂和繁殖，并具有完整植物的潜力。1943年，在美国，山羊在耿草成形物的集体培养中发现了花蕾，并对g.habarlanclt的理论进行了改进和成熟。它的理论和方法逐渐改进和成熟，并广泛应用于农业、林业、园艺、医药等行业。1植物组织培养技术的应用前景植物组织培养技术的应用前景很广泛,目前主要用在以下几个方面.1.1在农业生产上的应用植物脱毒和离体快速繁殖是目前植物组织培养应用最多、最有效的一个方面.很多农作物都带有病毒,特别是无性繁殖植物,如马铃薯、甘薯、草莓、大蒜等.但是,感病植株并非每个部位都带有病毒,White早在1943年就发现植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒.如果利用组织培养方法,取一定大小的茎尖进行培养,再生的植株有可能不带病毒,从而获得脱病毒苗,再用脱毒苗进行繁殖,则种植的作物就不会或极少发生病毒.此法已在马铃薯、大蒜、草莓、葡萄、康乃馨等多种作物上获得成功,并产生了明显的经济效益.国外40%~80%草莓是通过试管脱毒后繁殖的,意大利每个州都有年产百万草莓无毒种苗的工厂.由于运用组织培养法繁殖植物的明显特点是快速,每年可以数以百万倍的速度繁殖,因此,对一些繁殖系数低、不能用种子繁殖的名、优、特植物品种的繁殖,意义尤为重大.同时组织培养可不受地区、气候的影响,比常规方法快数万倍到数百万倍的速度扩大繁殖,及时提供大量优质种苗.目前,观赏植物、园艺作物、经济林木、无性繁殖作物等部分或大部分都用离体快繁提供苗木,试管苗已出现在国际市场上并形成产业化.1.2在植物基因型及基因转化方面的应用植物组织培养技术对培育优良作物品种开辟了新途径.目前,国内外把植物组织培养已普遍应用于作物育种,并在以下几个方面取得了较大进展:1.2.1单倍体育种单倍体植株往往不能结实,在培养中用秋水仙素处理,可使染色体加倍,成为纯合二倍体植株,这种培养技术在育种上的应用称为单倍体育种.单倍体育种具有高速、高效率、基因型一次纯合等优点,因此,通过花药或花粉培养的单倍体育种,已经作为一种崭新的育种手段问世,自从1964年Guha和Maheshwari报道利用花药培养技术由蔓陀罗花药诱导单倍体植株以来,各国科学家致力于花药培养.1974年,我国科学家用单倍体育种法育成世界上第一个作物新品种——单育1号烟草品种,现已有300种植物花药培养成功.其中我国首先培育出来的就有40余种,它们主要是粮食、油料、蔬菜、林木、果树等重要经济作物.据报道,水稻品种中花8号、9号等已累计推广面积超过66.67万hm2;小麦新品种京花1号、3号、甘春11号、甘肃花培746等也累计推广面积超过66.67万hm2.1.2.2离体胚培养和体外受精胚状体类似于植物种子中的胚,是完整植株的雏形,很容易形成完整的植株,这就克服了一些组培苗生根难的缺点.对胚状体的形成研究不但可为扩大繁殖系数,拓宽变异谱打下基础,而且也为将来制造人工种子和进行外源基因的导入打下基础.植物胚胎培养是采用人工的方法在无菌条件下从种子中把成熟胚或未成熟胚分离出来,然后放在人工合成的培养基上培养,使它发育成正常的植株,从而有效地克服了远源杂交不实的障碍,获得杂种植株.胚培养已在50多个科属中获得成功.远缘杂交中,可把未受精的胚珠分离出来,在试管内用异种花粉在胚珠上萌发受精,产生的杂种胚在试管中发育成完整植株,此法称为“试管受精”.用胚乳培养可以获得三倍体植株,为诱导形成三倍体植物开辟了一条新途径.三倍体加倍后可得到六倍体,可育成多倍体新品种.目前,已在怀地黄、矮牵牛、普通小麦、黑麦草等自交或远源杂交不亲和性植物的试管受精方面获得成功.1.2.3细胞融合植物体细胞杂交在植物远源杂交育种中,除了应用离体胚培养或离体受精和授粉培养技术之外,还可采用植物体细胞杂交技术——原生质体融合.由于不同来源的原生质体都有彼此融合的能力,在远源杂交中,通过细胞融合可获得种间、属间、科间、甚至界间的细胞融合体系,因此,细胞融合打破了种属间的界限,克服远缘杂交不亲和性障碍,在植物新品种的培育和种性改良中有着巨大的潜力.目前,采用原生质体融合技术已经能从不杂交的植物中如番茄和马铃薯、烟草和龙葵、芥菜和油菜等获得属间杂种,但这些杂种尚无实际应用价值.随着原生质体融合、选择、培养技术的不断成熟和发展,今后可望获得更多有一定应用价值的经济作物体细胞杂种及新品种.1.2.4在基因转化方面的应用基因转化是有目的地将外源基因或DNA导入植物细胞内,使之整合、表达并遗传,通过外源基因的导入,并植物体内表达,有目的地改变植物性状,以提高作物的抗逆性,改良作物品质.植物组织培养是外源基因导入植物细胞的关键技术,通过组织培养技术可以建立一个良好的植物转化系统,目前通常使用的再生系统有愈伤组织再生系统、直接分化再生系统、原生质体再生系统、胚状体再生系统和生殖细胞受体系统等,根据不同的植物材料选择不同的再生系统.在基因转化中,一个很重要的环节是抑制农杆菌生长,防止细菌过度生长而产生污染.为了解决这个难题,在培养基中经常添加对植物细胞无毒害作用的抑菌性抗生素(如头孢霉素、羧苄霉素).这类抗生素即能有效地抑制细菌的生长,又不影响植物的正常生长,同时能够有效地提高转化效率以及快速获得转基因植物.因此,组织培养技术的有效利用对基因转化的成功十分关键.从1983年第一株转基因植株问世以来,全世界已分离的目的基因有100多个,获得转基因植株近200种,其中农杆菌转化成功的植物已达近百种,有的已进入或正在进入商业开发阶段.1.2.5培养细胞突变体无论是愈伤组织培养,还是细胞培养,培养细胞均处在不断分生状态,容易受培养条件和外界压力(如射线、化学物质等)的影响而产生诱变,从中可以筛选出对人们有用的突变体,从而育成新品种.尤其对原来诱发突变较为困难、突变率较低的一些性状,用细胞培养进行诱发、筛选和鉴定时,处理细胞数远远多于处理个体数,因此一些突变率极低的性状有可能从中选择出来,例如植物抗病虫性、抗寒、耐盐、抗除草剂毒性、生理生化变异株等的诱发,为进一步筛选和选育提供了丰富的变异材料.目前,用这种方法已筛选出抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白、矮秆高产的突变体,有些已用于生产.1.3组织培养法低温保存种子所谓“人工种子”就是最外面为一层有机的薄膜包裹以保护水分子免于丧失及防止外部的物理力量冲击,中间含有培养物(胚状体、腋芽或微不定芽等)所需的营养成分和某些植物激素,最内则是被包埋的胚状体或芽,通过这几部分的组合,以人为方法制造出一种和天然种子相类似的结构.目前已有100多种植物可以经组织培养得到大量的胚状体,它有繁殖速度快和结构完整等特点,为制成人工种子用于生产提供了基础.近年来,由于环境污染和热带森林资源的破坏,平均每天有两种植物从地球上消失,世界种质资源日益枯竭,大量有用基因丢失,特别是那些不产籽植物或种子寿命短的植物更为严重.有人断言,谁掌握了种质资源,谁就掌握了农业的未来.因此,植物种质的保存引起了科学家和各国政府的极大重视.近10年来,研究出用组织和细胞培养法低温保存种质,为保存和抢救有用基因带来希望.由于植物许多组织和细胞培养物在液氮超低温贮藏后仍然保持很高的存活率并能再生出新植株,保持原来的遗传特性,这就为种质库的建立奠定了良好的基础.如用豌豆和草莓的茎尖为材料,在液态氮保存2年后,其中80%的茎尖能成活,胡萝卜和烟草等植物的细胞悬浮物,在-20~-196℃的低温下储藏数月,尚能恢复生长,再生成植株.利用组织培养试管保存植物种质资源,具有体积小、保存数量多、条件可控制、避免病虫害再度侵染、节省人力和土地以及便于国家和地区间的转移和交换等优点.组织培养法低温保存种质是一种经济有效的保存方法,各国都已建成或正在兴建一些组织培养的种质库,为保存基因资源以造福后代做出了贡献.1.4组织培养技术:生产和提取植物原生衍生物植物次生代谢物是许多医药、食品、香料、色素、农药和化工产品的重要原料,其需求量逐年增加,组织培养技术对植物次生代谢产物的生产提供了有效的途径.由于任何植物的离体细胞在人工培养下同样具有它们“母体”植物的那种合成药物成分的能力,并通过改变和调节培养条件,将有效地提高其含量和质量,为此,利用组织培养生产药物,已发展成为组织培养再生产应用的主流之一.在生产和提取植物次生代谢物的过程中,利用组织培养技术,可以大量生产植物次生代谢物,以满足和保证目前的需求量,同时也能够有效地保护日益短缺的野生药用植物资源.仅从20世纪90年代以来的植物药用有效成分国际专利就达50多项,其中多为抗病毒、抗癌化合物.1.5防止疫情扩散,引进植物、品种、种子植物检疫是运用法律手段来控制人为传播危险性病虫草害,保护农业生产的一种行政措施,技术性强,责任重大.在检疫技术、设备、手段相对滞后的今天,大量国外引种的同时,不可避免地会随之带入危险性病虫草.近年来,花卉作为一个新兴产业呈现出繁荣发展的景象,我国从海外引进花卉苗木的数量、批次呈逐年递增的趋势,与此同时,美洲斑潜蝇、拉美斑潜蝇、番茄环斑病毒等有害生物也会随之而入,直接影响花卉市场的发展.为了最大限度地防止疫情传入并扩散,采取限量引种,引进后进行组织培养,既可有效地防止危险性病虫草的传入,又节约了人力、物力.山葵的离体培养和植株再生在大陆的成功,就为限量从台湾阿里山引进山葵种苗提供了可靠的保证.2难以进行巩固试验的试验失败在组织培养过程中,常会遇到一些问题使试验无法进行下去,甚至导致整个试验的失败,给科研和生产造成损失.如培养过程中的污染、褐变和玻璃化是组织培养中公认的三大难题.2.1细菌污染.主要发生在培养过程中污染是经常发生的,造成污染的原因很多,如工作环境及仪器的因素、培养基及器皿灭菌不彻底、外植体带菌、操作时不遵守操作规程等,但造成污染的病原主要分为细菌和真菌两大类.真菌性污染主要指霉菌引起的污染.真菌性污染,一般多由接种室内的空气不清洁,超净工作台的过滤装置失效,操作不慎等原因引起.此类污染可通过完善操作、培养环境,严格操作程序来克服.细菌性污染的主要症状是培养材料附近出现粘液状和发酵泡沫状物体,或在材料附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹.细菌性污染除外植体带菌或培养基灭菌不彻底外,主要是操作人员的不慎造成.除要求操作人员严格按照无菌操作顺序操作外,对外植体带菌引起的污染,情况则比较复杂,与外植体的种类、取材季节、部位、预处理方法及消毒方法等密切相关.要取得理想的无菌材料,以春夏生长旺季、当年生的嫩梢为佳,且取材应尽量选择晴天中午进行,或取离体枝梢在洁净空气条件下抽芽,然后从新生组织中取材接种.另外,胚也是一个极好的外植体材料.外植体的彻底消毒是控制污染的前提,应根据不同材料选择合适的消毒剂和消毒方法,有些特殊材料还需进行预处理,为达到最佳消毒效果,对于材料内部带菌的组织,有时还需在培养基中加入适量抗生素.总之,通过努力,污染完全能控制在可接受的范围.2.2外植体的选用及材料选用切割材料时,组织中的酚类化合物被氧化产生棕褐色的醌类物质,进而使整个外植体组织受到伤害的现象称为褐变.褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系.在完整的组织和细胞中,二者是分隔存在的,切割使切口附近细胞受到伤害,酚类化合物外溢,因酚类化合物很不稳定,在酶的催化下迅速氧化而形成褐色醌类物质,进一步与组织中的蛋白质发生聚合,导致整个组织代谢紊乱,甚至死亡.褐变的产生受诸多因素的影响.首先要选择适宜的外植体,所选材料的年龄、取材部位、材料的大小及外植体受伤害程度等均能对褐变产生影响.一般幼龄材料褐变较轻,成龄树上的茎尖褐变则较严重;另外,茎尖小于0.5mm时,褐变严重,达70%以上,而随着切割长度逐渐增大,褐变逐渐减轻,以7~15mm较轻,成活率达87%.外植体受伤害程度直接影响褐变,切割时应尽可能减小伤口面积,并缩短切口暴露在空气中的时间.酒精消毒虽然效果较好,但易对材料造成伤害,导致褐化,升汞对外植体伤害比较轻.且消毒时间越长,消毒效果越好,但褐变越严重.因而,选择合适的消毒剂和消毒方法至关重要.此外,将易于褐变的外植体放在黑暗条件下培养一段时间,连续转移,进行预处理,选择合适的培养基、在培养基中加入抗氧化剂和活性炭等都会有效控制褐化的发生.陈学森等在银杏组织培养中应用了植酸作抗氧化剂,取得一定成效.2.3植物组培中玻璃化的克服方法玻璃化现象是指在培养过程中材料呈半透明状,组织结构发育畸形的现象.又称过度水化.“玻璃苗”是植物组织培养过程中特有的一种生理失调或生理病变,很难继续用作继代培养和扩繁材料,生根困难,移栽后也很难成活.它已成为茎尖脱毒、工厂化育苗和材料保存等方面的严重障碍,是进行组培工作的一大难题.目前玻璃化的根本原因尚无定论.吴若菁等在香石竹组培中,发现影响组培苗玻璃化的原因有以下几种类型:激素的种类、浓度、琼脂的浓度、外植体的取材部位、不适宜的培养条件.因此采取的克服方法也要因原因的不同而决定.克服植物组织培养中试管苗玻璃化有以下几项措施:(1)利用固体培养,增加琼脂浓度,降低培养基的衬质势,造成细胞吸水阻遏,可降低玻璃化;(2)适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂,降低培养基