免疫学实验凝集试验

实验一凝集试验颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutinationreaction)或凝集试验。参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。[目的要求]1.掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。2.掌握凝集试验的结果判定及判定标准。3.熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。[材料与试剂]1.玻板，载玻片，试管（1cmx8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。2.灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。3.布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。4.鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。[实验内容及操作方法]（一）试管凝集试验以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。1.试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试＋＋＋：有明显凝集块，液体几乎完全透明，即75%凝集。＋＋：有可见凝集块，液体不甚透明，即50%凝集。＋：液体混浊，有小的颗粒状物，即25%凝集。－：液体均匀混浊，无凝集现象。6.平板凝集试验与试管凝集试验的关系见表1-2。表1-2平板凝集试验与试管凝集试验的关系平板凝集80402010相当于试管凝集1:251:501:1001:2007.判定标准：同试管凝集试验。8.注意：对于阳性及可疑的被检血清需用试管凝集试验进行验证。（三）虎红平板凝集试验这种试验是快速平板凝集试验。抗原是布氏杆菌加虎红制成。虎红平板凝集试验可与试管凝集试验及补体结合试验效果相比，具有操作简单、快速、特异性强的优点。1.被检血清和布氏杆菌病虎红平板凝集抗原各30L滴于玻璃板的方格内，每份血清各用一支牙签或火柴棒混合均匀。在室温（202.结果判定：在阳性血清及阴性血清试验结果正确的前提下，被检血清出现任何程度的凝集现象均判为阳性，完全不凝集的判为阴性，无可疑反应。3.注意：抗原用前充分摇匀，抗原和被检血清用前应放室温30-60min后再进行试验。（四）鸡白痢平板凝集试验1.被检鸡血清和鸡白痢平板凝集抗原各1滴（约302.结果判定：在室温（20℃[思考题]1.凝集反应的原理是什么?2.哪些因素影响细菌凝集试验?3.凝集试验中为什么要设阳性、阴性血清及抗原对照？

实验二病毒的血凝及血凝抑制试验有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。[目的要求]掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。[材料与试剂]1.96孔“U”形或“V”形微量反应板，50L2.生理盐水，0.5%鸡红细胞悬液。3.新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。[实验内容及操作方法]（一）血球凝集(HA)试验1.在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加502.于左侧第1孔加50L病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃503.自右至左依次向各孔加入0.5%鸡红细胞悬液50表4-1病毒血凝试验的操作方法（单位：L）孔号123456789101112病毒稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照生理盐水505050505050505050505050病毒液50505050505050505050500.5%红细胞505050505050505050505050弃50结果观察+++++++++++++++++++++++++++++++++--4.结果判定：从静置后10min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100%凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。(二)血球凝集抑制(HI)试验1.根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。2.在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加503.第１孔加被检鸡血清50L，吹吸混合均匀，吸50L至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50L，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8……4.自第1孔至12孔各加505.自第l孔至12孔各加0.5%鸡红细胞悬液50表4-2病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：L）孔号123456789101112血清稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024病毒对照血清对照生理盐水5050505050505050505050被检鸡血清50505050505050505050504单位病毒505050505050505050505050室温中静置10min505050505050505050505050弃去50结果观察------++++++++++++++-6.结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（++++），而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。以100％抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。附录1.阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液枸橼酸钠（5H2O）0.80g枸橼酸（H2O）0.055g葡萄糖2.05g氯化钠0.42g双蒸水加至100ml将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115℃灭菌10min,42.0.5%鸡红细胞制备方法先用灭菌注射器吸取3.8%枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的1／5)，从鸡翅静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细