3种抗真菌药联合应用对临床分离致病皮肤癣菌的体外抗真菌活性

3种抗真菌药联合应用对临床分离致病皮肤癣菌的体外抗真菌活性

近年来，随着抗真菌药的出现和各种抗真菌药的不断诞生，正确、合理地选择抗真菌药已成为一个突出而紧迫的问题。药物敏感试验和现有临床分离细菌药物的敏感性是药物特性的基础。我们参照M38-P方案对临床分离的289株皮肤癣菌作了酮康唑、萘替芬、特比萘芬及酮康唑、萘替芬联合用药的体外敏感性测定,为临床合理用药提供必要的实验依据。1材料和方法1.1两种最优混料酮康唑、萘替芬由福建金山制药有限公司提供,含量为99.9%,联合用药由酮康唑及萘替芬按2:8比例混合(依据长征医院皮肤科真菌试验室反复试验后的最佳比例),特比萘芬由山东齐鲁药厂提供,含量为100%。将药物用40%的二甲基亚砜(DMSO)配制成12.8mg/ml的贮存液,-20℃冰箱贮存备用。1.2常规镜检、芽管试验及api20caux鉴定289株临床分离致病菌株分别来自中国医学科学院皮肤病研究所、北京协和医院、第二军医大学长海医院及本科,均经常规镜检、芽管试验和API20CAUX鉴定。质控菌株是由中国医学科学院皮肤病研究所菌种保藏中心提供的红色毛癣菌ATCC28188。1.3磺酸fluka1640培养液含BPMI164010.4g/L(美国LifeTechnologiesInc),三氮吗啡啉丙磺酸(MOPS,Fluka进口分装)34.53g/L,以1mol/LNaOH调节pH至7.0(恒温25℃),用Millipore滤过灭菌(滤膜0.22μm),置4℃冰箱备用。改良沙堡固体培养基(含葡萄糖2%,蛋白胨1%,琼脂2%,氯霉素0.05mg/ml),115℃高压蒸汽消毒20min,分装试管,置4℃冰箱保存备用。1.4第1孔至第11孔抗真菌药贮存液用配制好的RPML1640培养液做10级倍比稀释,将配制好的药液对应加在无菌96孔U形底微量板中的孔洞中,从第1孔至第10孔浓度由高到低,每孔100μ1,第11、12孔加不含药液的RPML1640培养液,其中第11孔为空白对照,第12孔为生长对照。使酮康唑的终浓度范围为0.063～32μg/ml,萘替芬、特比萘芬、酮康唑及萘替芬联合的终浓度范围均为0.0005～0.25μg/ml。超过试验浓度范围的菌株,经提高浓度重新检测。1.5微生物添加将受试菌株接种于SDA上连续转种2次,以保证其纯度与活力。皮肤癣菌新鲜移种菌株培养10d后加生理盐水用接种钩勾取菌落,倒入研磨器研磨均匀后经血细胞计数板调整密度为(0.4～5)×104CFU/ml,置超净工作台用微量移液器从第1孔至第12孔的顺序每孔加100μ1菌悬液,第11孔不加。此时各孔药液和菌悬液均分别达到应测试浓度。1.6受试菌药剂量选择接种后的药敏板置28℃温箱孵育,于培养5d观察受试菌结果,用视觉法判定终点,按M38-P方案要求以50%生长抑制所对应的最低药物浓度为MIC值。1.7抑菌浓度测定计算抑菌浓度指数(fractionalinhibitoryconcentrationindex,FICI),即联合用药时各药的最低抑菌浓度分别除以各药单用时MIC值的商的和。当FICI≤0.5时为协同作用;0.5<FICI≤1时为相加作用;1<FICI≤4时为无关作用;FICI>4时为拮抗作用。1.8统计处理将各药单用及联用时的两组MIC值转换为对数后进行SNK-q检验(多组均数两两比较)。2药物的mic值分布特比萘芬对皮肤癣菌的MIC值,几何均数最低(0.00811),其次为酮康唑、萘替芬联合(0.00971),单用酮康唑、单用萘替芬对皮肤癣菌的MIC值较高(分别为0.83018和0.01767)。药物对临床分离株的MIC分布见表1。不同菌种的数量及其MIC值范围见表2。不同抗真菌药物的MIC值转换为对数后经SNK-q检验(多组均数两两比较),结果显示在皮肤癣菌中联合用药优于单用酮康唑、单用萘替芬(P<0.05),联合用药与特比萘芬之间的差异无统计学意义。对皮肤癣菌的平均FICI值为0.612882(即两者有相加作用),其中FICI≤0.5(协同作用)的菌株有165株(57.094%),0.5<FICI≤1的有105株(36.332%),1<FICI≤4的有17株(5.882%),FICI>4的有2株(0.692%)。3抗真菌药联合应用随着临床上免疫抑制患者的深部及浅部真菌感染日益增多以及抗真菌药物的广泛应用,各种真菌对于抗真菌药物的耐药现象日益严重。在抗真菌药物发展相对缓慢的情况下,本试验通过3种药物及其联合应用对皮肤癣菌的MIC值的比较,来确定酮康唑及萘替芬联合应用的疗效,为临床联合应用抗真菌药提供体外试验依据。本试验结果显示,在皮肤癣菌组,联合应用酮康唑及萘替芬组优于单用酮康唑、单用萘替芬组,且表现出明显的协同或相加作用。该结果提示联合应用抗真菌药物进行抗真菌治疗的疗效优于单用一种药物,Gupta等、Barchiesi等研究认为其他抗真菌药联合应用也有协同、相加作用。酮康唑属咪唑类抗真菌药,作用机制是打乱真菌甾醇或脂肪酸的代谢或者影响真菌的氧化系统,引起毒性产物在细胞内聚集,造成代谢障碍等。萘替芬是丙酰胺类抗真菌剂,其作用机制为抑制麦角固醇的生物合成,角鲨烯在菌内的积聚,抑制角鲨烯环化酶及其他作用。酮康唑、萘替芬是作用途径不同的抗真菌药,联合应用疗效优于单一药物。酮康唑、萘替芬联合应用与特比萘芬之间无统计学意义,Jessup等曾研究特比萘芬与其他几种抗真菌药对皮肤癣菌的药敏试验,结果显示特比萘芬是对皮肤癣菌最有效的抗真菌药,Barchiesi等研究报道体外联合应用特比萘芬与氟康唑、伊曲康唑是有益的。提示临床在治疗皮肤癣菌感染时可以考虑特比萘芬与唑类药物联用。在目前抗真菌药物发展相对缓慢,真菌对抗真菌药物耐药程度越来越严重的情况下,联合用药进入临床会越来越多。在试验中我们观察到,有3例多次培养呈阳性的患者的结果显示,在用药的不同阶段所培养出的菌株的药物MIC值有升高现象。而在联合用药中此类菌株的