复方酮康唑的透皮吸收与体内蓄积性研究

复方酮康唑的透皮吸收与体内蓄积性研究

酮康唑是一种新型的异羟色胺抗真菌药物，对浅部和深层细菌感染均有良好疗效。丙酸氯倍他索(clobetasolipropionas)为肾上腺皮质激素类药,具有较强的抗炎、抗瘙痒和血管收缩作用。复方酮康唑软膏,其主要成分是酮康唑和丙酸氯倍他索。作为皮肤外用药的一个基本要求是安全低毒,即药物发挥局部疗效时对全身系统的影响较小。为观察皮肤涂用复方酮康唑软膏后其两种成分药物的透皮吸收及体内蓄积性,我室研究建立了高效液相色谱法同时测定兔血清酮康唑和丙酸氯倍他索血药浓度方法,对新西兰纯种大白兔皮肤单次和连续用药的血药浓度进行测定和研究。1方法和实验1.1标准对照品,见表14%复方酮康唑软膏(含酮康唑4%,丙酸氯倍他索0.1%),1%复方酮康唑软膏(含酮康唑1%,丙酸氯倍他索0.025%),均由广东顺峰药厂提供,批号960306;酮康唑标准对照品(含量99.8%,南京第二制药厂),丙酸氯倍他索标准对照品(含量99.5%,上海第十二制药厂),联苯苄唑标准对照品(99.54%,广州何济公药厂);醋酸乙酯、甲醇等试剂均为分析纯,水为三蒸水。1.2配液浓度的确定标准液:分别精密称取酮康唑对照品和丙酸氯倍他索标准对照品5.0mg,用甲醇配至10mL,再分别取此液20μL,用甲醇再稀释至1.0mL,浓度为10ng/μL;内标液:精密称取联苯苄唑标准对照品5.0mg,用甲醇配至10.0mL,再取此液200μL,用甲醇再稀释至1.0mL,浓度为0.1μg/μL。1.3紫外分离器aLC-3A高效液相色谱仪及C-R3A数据处理仪(日本岛津公司);Spectra100型紫外检测器(SP公司);YWG-C18色谱柱(4.6mm×15cm,中科院大连物化所),流动相为0.02mol/LNaH2PO4-甲醇(25∶75),流速为1mL/min;柱温30℃,柱压为80kg/cm2;检测波长:UV235nm。1.4色谱定位问题取2mL锥形玻璃带塞离心管,内加1μL内标液,吸取200μL带药血清加到离心管内,快速旋转振荡数秒后,加入400μL醋酸乙酯,快速旋转振荡40s,以2500×g离心5min,吸醋酸乙酯层于另一支2mL离心管内,于水浴60℃通N2吹干,色谱分析前残留物用甲醇20μL快速旋转振荡数秒溶解,精密吸取5～10μL进样行色谱测定。1.5内标血样的测定取6支2mL锥形离心管(已加有内标液1μL),分别加入两药标准液(10ng/μL)0.4,1,2,4,6,10μL。各管再加入空白兔血清200μL,快速旋转振荡数秒,即配制成带有内标的酮康唑和丙酸氯倍他索血药浓度分别为0.02,0.05,0.10,0.20,0.30,0.50mg/L的标准血样6支。每管加提取液按“样品处理”项下进行测定。经HPLC分析,测得酮康唑和丙酸氯倍他索的峰面积与内标峰面积之比(F)作纵坐标,以血清酮康唑浓度、血清丙酸氯倍他索浓度(C)作横坐标绘制标准曲线。在0.02～0.50mg/L范围内的血药浓度线性关系良好,其回归方程为:酮康唑F=3.202C-0.0625r=0.9994丙酸氯倍他索F=2.544C+0.069r=0.99991.6方法及回收率按标准曲线配制血清酮康唑和丙酸氯倍他索的高(0.5mg/L)、中(0.2mg/L)、低(0.05mg/L)浓度标样,按样品处理项下处理,日内测定3次,隔日测定1次,共5次,分别计算相对回收率,日内及日间RSD。1.7血药浓度测定实验分为单剂量给药透皮吸收试验和多剂量给药累积试验两部分。取新西兰大白兔15只,体重2.15～2.4kg,雌雄各半。分为三组,其中4%用药(高剂量)组6只,1%用药(治疗剂量)组6只,基质对照组3只。兔背两侧部剪去毛,暴露皮肤面积约150cm2(总面积约为兔体表面积的1/5)。(1)单剂量给药:每兔皮肤一次涂药5g,早上8:30给药,兔背两侧涂药面积(150cm2)。用药处用小纱布2层盖面,再依次用医用绷带和胶布包裹固定,单独关养,防止动物添吃药物。用药前和用药后0.5,1,2,3,4,5,8,14,24h从兔耳缘静脉吸取1.5mL血样进行两种药物的血药浓度测定。(2)多剂量给药:选用1%用药组进行实验。连续用药组的动物于第二次用药前取下胶布纱布,用生理盐水清洗用药皮肤,吸干后再行上药固定。每天涂药一次,连续7d,每天用药后2,24h取血测定。2结果2.1血药浓度标准曲线建立本实验建立的HPLC测定酮康唑和丙酸氯倍他索兔血清药物浓度测定方法,丙酸氯倍他索保留时间为5.5min,酮康唑为8.3min,内标为12.3min。经基质组动物血清平行分析对照,色谱行为并无明显干扰峰出现,见图1。实验中并未发现被测定药物在兔体内代谢峰互相干扰的现象。两药的直接提取率分别为75%和70%,最低检测浓度酮康唑为0.02mg/L,丙酸氯倍他索为0.01mg/L。为避免在实验中连续采血而影响兔的血容量,本测定法取血量仅为200μL,样品处理用试剂量较少,提取过程简便。由于皮肤给药血药浓度水平甚低,本实验血药浓度标准曲线建立在0.02～0.50mg/L范围。酮康唑和丙酸氯倍他索回收率和重现性,高(0.50mg/L)、中(0.20mg/L)、低(0.05mg/L)三个浓度的相对回收率分别为96.1%,107.5%,86.5%和103%,94.6%,102.5%;日内RSD分别为:1.9%,5.3%,3.6%和2.2%,2.0%,1.9%(n=3);日间RSD为:2.9%,5.1%,3.9%和3.7%,4.1%,3.3%(n=5)。2.2复方酮康唑唇膏透皮吸收检测高剂量组(4%复方酮康唑软膏,5g/24h)的血药浓度随时间的变化表明,酮康唑的透皮吸收于2h左右达峰,峰浓度为(0.11±0.09)mg/L,随后血药浓度下降,维持于一个较低水平,见图2。软膏另含丙酸氯倍他索0.1%,其透皮吸收少而缓慢,血药浓度于4h左右达峰,峰浓度为(0.06±0.02)mg/L,浓度时间曲线维持于低水平状态,见图3。治疗组(1%复方酮康唑软膏,5g/24h),酮康唑透皮吸收亦于2左右达峰,峰浓度为0.06±0.01mg/L,与高剂量组比较,峰值下降了41%,见图2。可见治疗剂量组的复方酮康唑软膏透皮吸收更少,个别样品血药浓度低于最低检测浓度。治疗剂量组丙酸氯倍他索(0.025%)的血药浓度变化趋势类似于高剂量组,但峰浓度更低,峰浓度只有0.04±0.02mg/L,为高剂量组峰浓度的69%,见图3。2.3d4-峰浓度法d4选用临床推荐剂量即1%剂量组进行多剂量累积试验,连续给药7d的血药浓度药时间曲线见图4和图5。结果显示,酮康唑峰浓度(用药后2h)从d1的(0.06±0.01)mg/L上升到d4的(0.19±0.09)mg/L,谷浓度(用药后24h)从d1的(0.02±0.005)mg/L上升到d4的(0.07±0.04)mg/L,峰浓度和谷浓度分别增加3.0倍。随后5,6,7三天,峰浓度和谷浓度处于平稳状态并略呈下降趋势,至d7峰浓度和谷浓度分别为d1的1.63倍和1.69和倍,因此,酮康唑没有体内累积作用现象的发生。结果亦显示,丙酸氯倍他索的峰浓度(为方便测定,统一取2h时间点)和谷浓度(用药后24h)变化趋势类似于酮康唑。峰浓度从d1的(0.03±0.01)mg/L上升到d4的(0.12±0.05)mg/L,增加3.77倍;谷浓度从d1的(0.01±0.002)mg/L上升到d4的(0.04±0.03)mg/L,增加3.45倍。随后5、6、7三天,峰浓度和谷浓度处于平稳状态并略呈下降趋势。因此,丙酸氯倍他索亦无体内累积作用。3透皮吸收特性有关人、兔口服酮康唑,以及兔用酮康唑阴道栓的血药浓度检测方法已有报道。皮肤外用酮康唑和丙酸氯倍他索的血药浓度则未见报道。研制安全低毒的皮肤外用药膏,要求药物高分布在皮肤局部而低透皮吸收于体内,其血药浓度极低,对实验检测方法学要求很高。本实验研究建立的检测方法学可同时测定血中两种药物,具有较好的线性范围和较高灵敏度,基本满足实验。实验结果,兔皮肤涂用复方酮康唑软膏后血药浓度极低,尤其是治疗量组(1%酮康唑和0.025%丙酸氯倍他索)的d1和d7部分样品在线性范围下,甚至低于最低检测浓度,表明此药膏具较低的透皮吸收性。文献报道家兔口服酮康唑混悬液200mg(与本实验皮肤给药高剂量组相同,4%×5g=200mg)后峰浓度为13.91mg/L,比本实验4%复方酮康唑软膏透皮吸收峰浓度(0.11±0.09mg/L)高出125倍,提示复方酮康唑软膏的透皮吸收入血量很少。此外,4%和1%软膏所用剂量相差4倍,但后者单次给药后的血药浓度时间曲线(AUC)约为前者的70%而不是25%,其原因尚未完全清楚,可能与软膏涂布后只有接触皮肤的一部分被吸收而外层软膏的药物未被吸收有关。显示该软膏皮肤局部用药后,其血药浓度并不随药物的剂量增加而呈线性增高,这对特殊情况下增加药物使用剂量有利。连续多次给予复方酮康唑软膏后,酮康唑和丙酸氯倍他索的体内血药浓度均较低,d4达到稳态浓度时酮康唑的峰浓度只有(0.19±0.09)m