hela细胞总蛋白双向电泳图谱提取方法的比较

hela细胞总蛋白双向电泳图谱提取方法的比较

1994年，wilkin和lawrence提出了蛋白质群的概念，其中一些是由遗传因子和组织的遗传因素引起的。蛋白质组学(Proteomics)是以蛋白质组为研究对象的新的研究领域。蛋白质组学研究和基因组学研究一样,依赖于强有力的、高通量的技术。蛋白质组学研究突飞猛进的发展依赖于1975年O′Farrell建立的双向凝胶电泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)技术。2-DE是目前可将数千种蛋白质同时分离的主要方法,是基于蛋白质的等电点和相对分子质量的不同而对蛋白质进行分离的。对2-DE来说,样品制备,即组织细胞蛋白的提取是关键,而不同的组织细胞具有不同的结构和组成成分,所适合的蛋白提取方法也各不相同。Hela细胞作为一种宫颈癌细胞,它的相关研究对临床肿瘤的攻克意义重大。因此本文对Hela细胞采用不同的样品处理方法提取细胞总蛋白,进行2-DE,通过软件分析比较2-DE图谱,选择适合Hela细胞的蛋白提取和纯化的方法,为进一步的研究奠定基础。1材料和方法1.1实验材料12细胞系统Hela细胞,本室保存。2试剂和培养基固相pH梯度干胶条(IPGstrippH3-10NL,7cm),IPG缓冲液(pH3-10NL),覆盖油、尿素、过硫酸铵、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、硫脲、DTT、碘乙酰胺、SDS、甘氨酸、Tris、CHAPS、PMSF、核酸酶混合物、Destreak试剂、2-Dclean-upkit均为Amersham公司产品;DMEM培养基为Gibco产品;胎牛血清、青霉素、链霉素为Hyclone公司产品;胰蛋白酶为Promega公司产品;BSA、考马斯亮蓝G250为Sigma公司产品。1.2dmem常规培养用含10%灭活胎牛血清及1%双抗(青霉素和链霉素混合液)的DMEM培养液在37℃,5%CO2及一定湿度条件下对Hela细胞进行常规培养,2～3d传代(0.25%胰酶消化)。传代培养48h后分别按以下方法提取细胞总蛋白。1westernblot,分离,清定总蛋白,并将其作为定型模型,制备成蛋白2.2%;传代培养48h后的细胞PBS洗3次,加入裂解缓冲液(每1.5×106个细胞大约加入100μL裂解液,裂解液含尿素7mol/L,硫脲2mol/L,CHAPS2%,DTT65mmol/L,PMSF10mmol/L,核酸酶混合物20μL,IPGbuffer2%),用细胞刮将细胞刮下,收集到1.5mLEppendorf管中,于-80℃反复冻融裂解细胞,释放出蛋白,4℃,40000g,离心1h,吸取上清并用Brandford法定量蛋白,分装,-20℃保存备用。2细胞培养和超声处理传代培养48h后的细胞胰酶消化,离心(室温,1200g,10min)收集细胞沉淀;PBS洗细胞3次(室温,1000g,各5min);将细胞分装到1.5mLEppendorf管中,吸干残留的PBS;加入裂解缓冲液(同上),冰浴加超声处理2h,超声条件为:100W,超3s停3s,30个循环;4℃,40000g离心1h;吸取上清,Brandford法定量蛋白,分装,-20℃保存备用。3裂解液的制备将Hela细胞按1.2中2)方法收集,加入裂解液后室温振荡1h,使其充分裂解;4℃,40000g,离心1h;吸取上清,蛋白定量,分装,-20℃保存备用。4dtt的提取将1.2中3)所得蛋白样品按2-Dclean-upkit试剂盒说明书操作进行。所得沉淀溶于水化液(含尿素7mol/L,硫脲2mol/L,CHAPS4%,DTT55mmol/L,IPGbuffer0.5%)中,可选择Destreak试剂代替DTT。Brandford法定量蛋白,分装,-20℃保存备用。5投资及染色蛋白上样量为300μg。一向等电聚焦:使用7cmpH3-10NL固相pH梯度胶条,水化加等电聚焦程序为:30V6h,60V6h,200V30min,500V30min,1000V1h,8000V1h,Grad8000V18000Vhs。平衡:分两步,分别用含DTT和碘乙酰胺的平衡液平衡15min。二向SDS:用12%的分离胶,胶条置于其上,0.5%琼脂糖封顶,进行电泳:5mA/胶,20min,10mA/胶,3～4h。染色:采用改进的胶体考马斯亮蓝G250染色。脱色后扫描:选用透射模式,256灰阶扫描,分辨率300dpi。软件分析:用ImageMaster2DPlatinum软件对2-DE图谱进行分析。2蛋白点的纯化分别采用几种不同的蛋白提取方法提取Hela细胞的总蛋白,相同的电泳条件下获得了不同的2-DE图谱,如图1、2、3所示。从中可以看出,反复冻融裂解法得到的2-DE图谱蛋白点数较少(400±),且有拖尾现象,尤其是横向条纹严重(图1A/2A);超声加冰浴裂解法得到了700±的蛋白点,横向条纹明显减少(图1B/2B);室温振摇裂解法得到了800±的蛋白点,拖尾现象明显减少(图1C/2C);2-Dclean-upkit纯化后得到了800±的蛋白点,基本没有拖尾现象(图1D/2D);2-Dclean-upkit纯化后加Destreak试剂得到了900±的蛋白点,碱性端拖尾明显得到抑制(图1E/2E),但纯化的同时有低丰度蛋白的丢失,且造成了高丰度蛋白的富集,见图3中间位置。(图2和图3分别为对应图1箭头及图框所示位置的局部放大图)。3细胞蛋白的纯化目前,就2-DE技术的样品制备而言,临床血清的蛋白质组学分析中样品制备相对较简单,只要去除高丰度蛋白的影响即可进行进一步的分析;而组织和细胞的蛋白质组学分析中,样品制备方法很多,不同的实验室往往针对自己的研究需要采用不同的样品制备方法。在我们的实验范围内,通过对上述几种不同处理方法的2-DE图谱分析发现:1)采用反复冻融裂解法可以释放大量的细胞蛋白,但包括核酸在内的杂质对电泳的干扰较大,导致了严重的条纹和拖尾,不能直接用于下一步的研究,需要进一步纯化处理。2)采用超声加冰浴裂解法和室温振摇裂解法得到的2-DE图谱没有太大的区别,横条纹和纵条纹都明显减少,可能在振摇和超声的过程中破坏了部分蛋白和其它物质的相互作用,使之更好地释放,可以用于进一步的分析研究。3)室温振摇裂解法得到的蛋白进一步用2-Dclean-upkit纯化后2-DE图谱拖尾现象显著抑制,尤其是Destreak试剂的添加对碱性端横向条纹的去除起了很大作用,使靠近碱性端的蛋白更多地释放。但在2-Dclean-upkit纯化的过程中会有占总蛋白量约1/3的蛋白丢失,其中大部分是低丰度蛋白,而高丰度蛋白得到了更大的富集。因此虽然纯化后由于蛋白