单宁酸与牛血红蛋白分子相互作用的荧光光谱研究

单宁酸与牛血红蛋白分子相互作用的荧光光谱研究

单宁酸作为一种传统药物和配方的活性成分，具有止血、抑制微生物、抗过敏、突变、抗癌、抗瘤、抗衰老等生理活性。有关单宁酸与蛋白质的研究已经成为了皮革工业、医药学、分析化学等领域的研究热点。单宁酸与蛋白质作用的模式和作用力类型的研究也显得极为重要。关于有机药物小分子与蛋白质的相互作用机理,人们从作用位点、作用力模型及其结合形态方面进行阐述,生物医学中单宁酸与血清白蛋白的研究较多,而其与血红蛋白相互作用的文献报道较少。为此本文对有机分子单宁酸和血红蛋白相互作用进行了荧光光谱分析,为进一步研究阐明单宁与蛋白作用的实质奠定一定实验基础,也为进一步研究生物大分子和有机药物分子相互作用本质提供理论依据。1实验部分1.1水能、水纯水及试剂LS-50B型荧光光度计(美国Perkin-Elmer公司);UV/Vis紫外-可见光谱仪(德国);PHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂);ZC-18Q智能型超级恒温水槽(宁波天恒仪器厂);高纯水制备仪(日本Millipore公司)。单宁酸(生化试剂,上海国药集团化学试剂有限公司)配制成3.75×10-4mol·L-1的储备液待用;牛血红蛋白(购于Sigma公司),用三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲溶液(内含0.15mol·L-1NaCl维持离子强度)配制成3.0×10-6mol·L-1储备溶液并于冰箱中(温度低于5℃)保存。除Tris为生化试剂外,其余试剂均为分析纯试剂,实验用水为高纯水(电阻率为18.2MΩ·cm-1)。1.2荧光扫描和同步荧光光谱移取2.5mL3.0×10-6mol·L-1BHb溶液于1cm的石英比色皿中,用微量注射器逐次加入3.75×10-4mol·L-1的单宁酸溶液进行荧光滴定(滴定剂累加体积小于65μL),每次加入溶液后混合均匀,在一定温度下作用10min后,于280nm激发波长下进行荧光扫描。光源为脉冲氙灯,发射与激发狭缝宽度均为5.0nm,扫描速度500nm·min-1,在LS-50B型荧光分光光度计上记录290nm~400nm波长范围内的发射光谱;固定△λ=15nm或△λ=60nm,记录单宁酸与BHb作用的同步荧光光谱。以Tris-HCl缓冲液为溶剂稀释单宁酸储备液,配制3.0×10-6mol·L-1的溶液测定其在290nm~400nm的UV/Vis谱图。2结果与讨论2.1荧光n,b对-33trp的荧光实验设计图1为是激发光波长为280nm时,血红蛋白的荧光发射光谱随单宁酸浓度变化的谱图。由图1可观察到在341nm处的1个强的宽荧光发射峰,为BHb中色氨酸和酪氨酸残基的荧光发射峰,单宁酸的加入使其荧光强度降低,表明二者发生了相互作用,发生了能量转移。另外随着单宁酸浓度的增加,BHb的荧光发射峰的峰位由341nm红移至353nm,说明单宁酸与BHb的结合使BHb分子的空间构象发生了改变,由于位于血红蛋白疏水腔内的β-37Trp是血红蛋白内源荧光的主要来源,其荧光的变化能够体现血红蛋白四级空间构象的改变,因此单宁酸分子在一定程度上对β-37Trp的荧光猝灭表明其影响了BHb的载氧功能。荧光猝灭过程通常可以分为动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用引起的,其过程遵循Stern-Volmer方程:F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q](1)式中F0和F分别表示不加入和加入猝灭剂时体系的相对荧光强度;Ksv为动态猝灭常数(即Stern-Volmer猝灭常数);[Q]为猝灭剂的浓度;Kq为荧光猝灭速率常数,各类猝灭剂对生物大分子的最大Kq值一般为2.0×1010L·mol-1·s-1;τ0为不存在猝灭剂时荧光物质的平均寿命,生物大分子的荧光平均寿命一般约为10-8s。根据图1,假设单宁酸对BHb的荧光猝灭过程为动态猝灭,则由式(1)作出荧光发射峰在341nm处BHb荧光猝灭的Stern-Volmer曲线,由直线的斜率及截矩可求出不同温度下结合反应的Ksv和Kq,计算结果见表1。从表1可以看出,Kq的数值在1013数量级,远大于动态猝灭的Kq值2.0×1010L·mol-1·s-1,随着温度的升高KSV有所降低,从这种意义上考虑,单宁酸对BHb的荧光猝灭作用不是由扩散和碰撞引起的动态猝灭,而是单宁酸与BHb形成了基态复合物,对BHb内源性荧光的猝灭过程应为静态猝灭。2.2最佳相互作用的确定作用力类型单宁酸对BHb的猝灭机理为静态猝灭,二者的结合符合荧光物质-猝灭剂间的结合表达式:logF0−FF=logKA+nlog[Q](2)logF0-FF=logΚA+nlog[Q](2)式中[Q]为溶液中单宁酸的浓度。由式(2)作log[(F0-F)/F]~log[Q]图,由图中直线的斜率及截矩计算不同温度下单宁酸与BHb表观结合常数KA、结合位点数n,结果见表2,数据表明,单宁酸与BHb分子之间具有较强的相互作用,并能够形成复合物。当温度变化不大时,结合反应的焓变ΔH⊖可看成一个常数,根据下列热力学公式(3~5)可以求得结合反应的标准吉布斯自由能变ΔG⊖、焓变ΔH⊖、熵变ΔS⊖(见表2)。ΔG⊖=-RTlnK⊖(3)ΔS⊖=(ΔH⊖-ΔG⊖)/T(4)lnK⊖2K⊖1=ΔH⊖R(1T11T2)(5)lnΚ2⊖Κ1⊖=ΔΗ⊖R(1Τ11Τ2)(5)根据药物小分子与生物大分子作用的有关热力学参数可以简单判断其相互作用力类型:若ΔH⊖<0及ΔS⊖>0时,主要表现为静电作用;若ΔH⊖<0及ΔS⊖<0时,主要表现为氢键或范德华作用力;若ΔH⊖>0及ΔS⊖>0时,主要表现为疏水作用。单宁多酚中的棓酰基是一种疏水性基团,它使多酚能够很好的与蛋白质分子中的疏水位置发生疏水缔合,疏水键应该是单宁酸与蛋白质结合的一种重要结合方式。从表2可以判断,单宁酸与BHb的结合是一个自发过程(ΔG⊖<0);单宁酸与BHb结合的ΔH⊖>0,ΔS⊖>0,可以确定单宁酸与BHb分子间主要存在疏水作用;同时,多酚的酚羟基与蛋白质的极性基团发生两点氢键结合,因此单宁酸与BHb分子间存在一定的氢键结合作用。2.3荧光量子产率的计算方法根据Förster能量转移理论,能量转移效率E与供体-受体间距离r以及临界能量转移距离R0之间的关系为:E=1−FF0=R60R60+r6(6)E=1-FF0=R06R06+r6(6)式中R0为E=50%时临界距离,R6006=8.79×10-25K2N-4ϕJ(7)式中K2为偶极空间取向因子,N为介质的折射系数,ϕ为供体(BHb)的荧光量子产率,J为供体(BHb)荧光光谱与受体(单宁酸)吸收光谱的重叠积分J=∫∞0F(λ)ε(λ)λ4dλ∫∞0F(λ)dλ(8)J=∫0∞F(λ)ε(λ)λ4dλ∫0∞F(λ)dλ(8)式中F(λ)为荧光供体(BHb)在波长λ处的荧光强度,ε(λ)为受体(单宁酸)在波长λ处的摩尔吸光系数。图2为BHb荧光发射光谱与单宁酸吸收光谱的重叠图,由(8)式计算的重叠积分J=2.47×10-14cm3·L·mol-1;取向因子取供体-受体各项随机分布的平均值,即K2=2/3;根据文献取BHb中色氨酸残基的荧光量子产率Φ为0.062,N折射指数取水和有机物平均值N为1.336;将上述数值代入式(6)、(7)求得E=0.117;R0=2.56nm,r=3.59nm,同时从计算的结果看出,单宁酸与BHb分子中色氨酸残基的距离r<7nm,且0.5R0<r<1.5R0,表明BHb与单宁酸之间存在能量转移的可能性较大,另外r>R0,说明单宁酸对BHb内源性荧光的猝灭过程主要为静态猝灭。2.4单宁酸对brb分子中氨基酸和色氨酸残基的作用同步荧光具有灵敏度高和选择性好等优点,通过选择合适的波长差可将在普通荧光光谱上相互重叠的荧光峰分开。对于蛋白质的同步荧光光谱,△λ=15nm时仅表现为酪氨酸残基的荧光,△λ=60nm时则显示色氨酸残基的荧光。因残基的最大发射波长与其所处环境的极性有关,故由发射波长的改变可判断蛋白质构象的变化。若最大发射波长红移,表明残基所处环境的极性增加,疏水性降低,蛋白结构变得疏松;蓝移则疏水性增加,蛋白结构变得紧密。固定BHb浓度,逐渐增大单宁酸的浓度,绘制BHb的同步荧光光谱。分别选择波长差△λ=15nm和△λ=60nm考察单宁酸对BHb分子中酪氨酸和色氨酸残基的影响(图3A、B)。从图中可以看出,随着单宁酸浓度增大,酪氨酸和色氨酸残基荧光被猝灭,特征荧光光谱峰位置发生红移,表明单宁酸对酪氨酸和色氨酸残基所处微环境有一定的影响。在血红蛋白α1β2亚基界面的α-42Tyr,α-140Tyr,β-37Trp和β-145Ty