甲硝唑与牛血清白蛋白作用的对比研究

甲硝唑与牛血清白蛋白作用的对比研究

硝基溶胶（met）是当前结构的简单结构（见图1）。广泛使用且廉价的抗厌氧菌药物用于抗厌氧菌感染，如腹腔、胃肠道、女性殖器、下呼吸道、皮肤、软组织、骨骼和关节。它也用于抗凝剂和替代物。血清苍白是血浆中最丰富的蛋白质。它可以与许多内源性和外源性化合物结合。药物研究和血清苍白是阐明药物储存和运输过程、药物设计和开发以及药理学研究的价值。这是当今科学研究、化学和临床医学的一个共同兴趣和兴趣。荧光光谱是研究生物大分子与有机小分子相互作用的重要手段之一.共振光散射光谱是一种新的分子光谱技术,由于这种技术在研究生物大分子识别、组装和聚集时呈现出灵敏而丰富的信号,已广泛用于生物大分子的定量分析.但应用共振光散射光谱研究药物与生物大分子作用机理未见报道本文用荧光光谱在模拟人体生理pH值条件下研究甲硝唑与牛血清白蛋白(BSA)之间的相互作用机理的同时,用共振光散射光谱讨论MET与蛋白质的结合机理,发现两种光谱得到的不同温度下MET对蛋白质的猝灭常数KSV、静态猝灭结合常数KLB、表观结合常数KA均在相同的数量级范围内,MET在蛋白质上的结合位点数均近似为1.本文还报道了MET与BSA间的热力学参数、作用力、作用距离等重要信息及MET对BSA构象的影响,试图从分子水平了解蛋白质分子与小分子间相互作用机制,为生命科学研究提供有用的信息.1实验部分1.1研究对象RF-5301PC型荧光分光光度计(日本岛津公司);PHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂);UV-530型紫外-可见分光光度计(日本JASCO公司);FC-204电子分析天平(上海天平仪器厂);501型超级恒温器(上海实验仪器厂).甲硝唑(MET,纯品原料药,由四川乐山长征制药厂提供)工作液:2.60×10-3mol·L-1;牛血清白蛋白(BSA,上海伯奥生物科技有限公司)溶液:5.20×10-5mol·L-1;NaCl溶液:0.5mol·L-1;pH=7.40的Tris-HCl缓冲溶液.除MET、BSA外,其余试剂均为分析纯,实验用水为二次去离子水,经检验无荧光杂质.1.2荧光光谱分析在10mL比色管中依次加入0.5mol·L-1的NaCl溶液2.00mL、BSA溶液2.00mL及一定量的MET工作液,以Tris-HCl缓冲溶液定容为10.0mL用狭缝宽度分别为3nm的RF-5301荧光分光光度计在激发和发射光谱,测定一定温度时BSA及BSA在MET作用下的荧光光谱、同步荧光光谱、共振光散射光谱;用UV-530型紫外-可见分光光度计测定MET的紫外吸收光谱.2结果和讨论2.1光谱特征2.1.1met和bsa的荧光发射波长对检测的影响蛋白质的荧光猝灭可用于研究药物与蛋白质的结合信息,当激发波长为280nm时,蛋白质表现的是色氨酸和酪氨酸残基的荧光.而激发波长为295nm时,仅仅表现色氨酸残基的荧光.图2表明了蛋白质的荧光强度随MET浓度的增加而熄灭的过程.在两种激发波长下.MET在300-450nm范围内并无荧光,从图2可见,当MET和BSA发生作用后,BSA的荧光发射波长发生红移,且发射波长红移的值随MET浓度的增加而增加,当MET和蛋白质的摩尔比达到30.0时,蛋白质荧光发射波长移动了25nm.红移表明蛋白质里的色氨酸残基被带到了一个更亲水的环境.2.1.2met对bsa共振光散射光谱的影响图3为MET对BSA共振光散射光谱的影响由图3知,随着MET浓度的增大,其蛋白质的共振光散射峰红移,且发生共振光散射强度猝灭的现象.2.2甲硝唑对蛋白质的工作特性荧光猝灭通常可分为动态猝灭和静态猝灭.动态猝灭过程遵循Stern-Volmer方程:静态猝灭过程遵循Lineweaver-Burk方程:其中cQ是猝灭剂的浓度,Kq为双分子猝灭过程速率常数,KSV为动态猝灭常数,τ0为猝灭剂不存在时荧光分子寿命.生物大分子的荧光平均寿命约为10-8s.F0为无猝灭剂时BSA的荧光,F为有猝灭剂时BSA的荧光.KLB为静态荧光猝灭结合常数.在不同温度下,用MET作猝灭剂,以343nm处的荧光强度作Stern-Volmer曲线和Lineweaver-Burk双倒数曲线,见图4.由图4可见,当药物和蛋白质的摩尔比超过10.5时,动态猝灭曲线不呈线性关系,且随cMET的增加,呈现出向上弯曲的现象.而静态猝灭曲线则呈现良好的线性关系,初步说明MET对蛋白质荧光的猝灭过程为静态猝灭,为进一步证实其猝灭过程,对图4a的线性部分及图4b进行线性拟合,由直线斜率求得猝灭常数KSV、双分子猝灭常数Kq、静态猝灭结合常数KLB,见表1.在动态猝灭过程中,一般情况下各类猝灭剂对生物大分子荧光寿命衰减速率影响的Kq值不大于2.00×1010L·mol-1·s-1.因此,甲硝唑对蛋白质的猝灭不是动态猝灭,而是甲硝唑与蛋白质结合引起的静态猝灭.药物与蛋白质之间的相互作用一般采用位点结合模型来描述,依据文献推导出的荧光强度(F)、猝灭剂浓度(cQ)与表观结合常数(KA)及结合位点数(n)之间的关系:以lg(F0-F)/F对lgcQ作图,MET为猝灭剂,由直线斜率可得298K时,MET与蛋白质的结合位点数n=1.06±0.02(曲线的相关系数为r=0.9981),表明1分子的甲硝唑和1分子的蛋白质结合.即甲硝唑与BSA作用时具有1个独立的结合部位.由直线截距可计算出在298K下甲硝唑与蛋白质的表观结合常数KA=2.22×104L·mol-1.2.3荧光符合谱分析的初步筛选在蛋白质溶液中,随着甲硝唑浓度的增加,其蛋白质的共振光散射强度依次降低,这可能是由于甲硝唑在血清白蛋白表面结合后,破坏了白蛋白表面的保护水层,使原来较为分散的蛋白质更加分散,即所谓的解聚作用,引起蛋白质粒径减小,共振散射的截面积减小,导致共振散射强度下降.当反应体系中共振光散射为蛋白质产生时,设I0为无猝灭剂时BSA的散射光强度,I为有猝灭剂时BSA的散射光强度,以349nm处散射光强度作Stern-Volmer和Lineweaver-Burk曲线,见图5.并由图5可求得猝灭常数KSV和静态猝灭结合常数KLB,见表2.将(3)式用于此体系得出在298K时,甲硝唑与蛋白质的结合位点数n=1.10±0.06(曲线的相关系数r=0.9902),甲硝唑与蛋白质的表观结合常数KA=3.48×104L·mol-1.将图5与图4相比较可发现,用Stern-Volmer方程和Lineweaver-Burk方程处理散射体系与处理荧光体系得到的结果非常相似,比较表1和表2,所得猝灭常数KSV、静态猝灭结合常数KLB都在相同的数量级范围内.两种光谱得到的结合位点数及表观结合常数也非常接近.说明荧光猝灭理论同样适合药物对蛋白质共振光散射强度的猝灭.2.4静态猝灭结合常数药物与生物大分子的作用力包括氢键、范德华力、静电引力、疏水作用力等.药物不同,与蛋白质作用力类型不同,当温度变化不大时,反应焓变ΔH可看作是一常数,由式和表1的静态猝灭结合常数可求得MET的ΔrGm、ΔrHm、ΔrSm,见表3.由于ΔrHm>0,ΔrSm>0.从热力学角度看,MET主要通过疏水作用与BSA发生结合反应.2.5临界能量转移距离通过测定甲硝唑吸收光谱并与BSA发射光谱比较,发现两者有较大部分重叠,如图6所示,说明两者之间存在着能量传递过程.按照F$rster偶极-偶极无辐射能量转移机理,供能体与受能体之间的结合距离(r)、临界能量转移距离(R0)及能量转移效率E符合以下关系:而临界能量转移距离(R0)又与偶极空间取向因子K2,供能体荧光量子产率!、介质折射指数n有关:其中J是供能体的荧光发射光谱与受能体吸收光谱的重叠积分F(λ)为荧光供能体在波长λ处的荧光强度,ε(λ)为受能体在波长λ处的摩尔吸收系数,将图6中MET的吸收光谱与BSA的荧光发射光谱的重叠部分分割成极小的矩形,按式(9)积分,得到J=6.49×10-15cm3·L·mol-1.取向因子取授体-受体各项随机分布的平均值K2=2/3;BSA中色氨酸残基的量子产率φ=0.118;折射指数取水和有机物的平均值n=1.336;由式(8)得到能量转移临界距离R0=2.28×10-7cm;能量转移效率E由(10)式计算得E=0.124,再根据(7)式进一步求出MET与BSA的结合距离r值为3.16nm.2.6甲硝唑对蛋白质同步荧光光谱的影响对于蛋白质的同步荧光光谱,Δλ=15nm只表现出酪氨酸残基的荧光,Δλ=60nm时只表现出色氨酸残基的荧光.因为氨基酸残基的最大发射波长与其所处环境的疏水性有关,因此由发射波长的改变可判断蛋白质构象的变化.图7为甲硝唑对蛋白质同步荧光光谱的影响,可见酪氨酸残基的最大发射波长基本保持不变,而色氨酸残基的最大发射波长红移,表明甲硝唑的加入使BSA的构象发生变化,色氨