hflpme-hplc法结合测定6种黄酮类化合物

hflpme-hplc法结合测定6种黄酮类化合物

1与药物的相互作用黄酮类化合物广泛分布于蔬菜、水果、食品、药物和药物中。这是植物自长期自然选择过程中产生的一些次级代谢产物。黄酮类化合物具有广谱的药理活性,如抗菌、消炎、降压、抗氧化、抗癌及防癌等。药物血浆蛋白结合率是药代动力学的重要参数之一,影响药物在体内的分布、代谢和排泄速率,对药物的消除半衰期也有影响,更重要的是它与药物的药理作用强度密切相关。因此,药物血浆蛋白结合率的研究对新药研究开发及指导临床合理用药都具有重要意义。测定药物血浆蛋白结合率的方法有平衡透析法、超滤法、微透析法、毛细管电泳法及高效亲和色谱法等,研究黄酮类化合物与蛋白结合特性的方法主要有紫外光谱法、荧光光谱法、圆二色谱法和红外光谱法。徐倩等采用分子对接理论和荧光法研究了4种黄酮类天然产物与白蛋白的相互作用及作用机理。但尚未见黄酮类化合物与蛋白结合率的文献报道。近年来,中空纤维液相微萃取(Hollowfiberliquidphasemicroextraction,HFLPME)对复杂样品中微量组分的提取、分离、富集和浓缩起重要作用。中空纤维具有能使药物分子通过,生物大分子或结合药物的生物大分子不能通过的特殊结构。利用中空纤维的结构特性测定药物与蛋白的结合率已有报道。本研究采用该方法,同时、快速测定了6种黄酮类化合物与牛血清白蛋白的结合率;分析了6种黄酮类化合物同时存在时对蛋白结合的竞争作用;讨论了黄酮类化合物蛋白结合率的浓度依赖性;计算了结合常数和结合位点数。2scatchird方法学sHFLPME是将水相中的游离药物通过中空纤维的壁孔萃取到其管内微升级的有机溶剂萃取相中,萃取达平衡时,萃取相中分析物浓度与样品的初始浓度呈线性关系。当药物与蛋白结合达到平衡时,水相中的药物一部分以蛋白结合型药物存在,一部分以游离型药物存在。游离型药物通过中空纤维的壁孔被萃取到萃取相中,结合型药物被中空纤维壁的微孔有效阻挡,使蛋白结合型药物与游离型药物有效分离。在生物体条件下,利用HFLPME结合HPLC测定萃取相中游离药物(Df)的浓度,用药物总浓度与游离药物浓度差值计算结合型药物(DnP)浓度,从而得出药物与蛋白结合率。药物与蛋白反应达到平衡时,蛋白结合常数K为:K=[DnP][Df]n[Pf](1)Κ=[DnΡ][Df]n[Ρf](1)其中[Df],[Pf],[DnP]分别表示药物与蛋白结合达平衡时游离药物、游离蛋白、药物-蛋白复合物的平衡浓度。设药物的总浓度为[D0],则:[DnP]+[Df]=[D0](2)药物的蛋白结合率fd为:fd=[DnP][D0]=[D0]−[Df][D0]fd=[DnΡ][D0]=[D0]-[Df][D0](3)设蛋白总浓度为[P0],则:[DnP]+[Pf]=[P0](4)蛋白与药物的结合位点是相互独立的,其平衡关系可以用多级平衡方程式(5)表示:R=[DnP][P0]=[D0]−[Df][P0]=Σi=1mniKi[Df]1+Ki[Df](5)R=[DnΡ][Ρ0]=[D0]-[Df][Ρ0]=Σi=1mniΚi[Df]1+Κi[Df](5)其中,R为结合比(一个蛋白键合的药物分子数),m为结合位点总类数,ni为第i类位点数,Ki为第i类位点的结合常数。如果药物与蛋白只有一类结合点位,即m=1,方程可以简化为:R=nK[Df]1+K[Df](6)R=nΚ[Df]1+Κ[Df](6)Bjerrum方法:根据式(6),以R对log[Df]作图,得到带有明显拐点的S型曲线,即Bjerrum图。Bjerrum法认为:如果药物与蛋白的结合分子数与结合位点数相等,Bjerrum曲线拐点处对应纵坐标R值为该药物与蛋白的结合位点数(即Rmax=n),Bjerrum曲线拐点对应横坐标的倒数为K。Scatchard方法:由式(6)变形得到:R/[Df]=nK-RK(7)根据式(7),以R对R/[Df]作图或进行线性回归,得到Scatchard方程。Scatchard法认为:假设每个结合位点结合一个药物分子,则Scatchard方程斜率的负数为结合常数即K。一个结合位点或几个结合位点与药物有相同的亲和力,则Scatchard方程为一条直线;如果两个结合位点有不同的亲和力,则Scatchard方程为两条直线,分别对应两个结合位点。3实验部分3.1药品、化学品和其它试剂Technologies1200Series高效液相色谱仪(Agilent公司);槲皮素(批号:081-9003,纯度≥98%)和白杨素(批号:111701-200501,纯度≥98%)对照品购自中国药品生物制品检定所;山柰素(批号:A0129,纯度≥98%)、异鼠李素(批号:A0190,纯度≥98%)、杨梅素(批号:A0048,纯度≥98%)和二氢杨梅素(批号:A0049,纯度≥98%)对照品购自成都曼思特有限公司。其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。3.2流动相乙腈-甲醇法EclipseXDB-C18柱(150mm×4.6mmi.d.,5μm,Agilent公司),检测波长为300nm,柱温35℃,进样量20μL,流动相乙腈(A)-甲醇(B)-0.3%H3PO4(C)用0.45μm微孔滤膜过滤。洗脱程序:0~3min,35%B+65%C(V/V),1mL/min;3~5min,47%B+53%C,1mL/min;5~8min,26%A+21%B+53%C,0.6mL/min;8~12min,47%B+53%C,0.8mL/min;12~15min,60%B+40%C,1mL/min。3.3溶液的制备3.3.1对照品储备液的制备准确称取二氢杨梅素、杨梅素、槲皮素、山柰素、异鼠李素和白杨素对照品各6.0,6.0,7.5,7.5,2.0和6.0mg,分别置于10mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成浓度分别为600,600,750,750,200和600mg/L的对照品储备液,于4℃冰箱保存,待用。分别准确吸取二氢杨梅素、杨梅素、槲皮素、山柰素、异鼠李素和白杨素对照品储备液2.08,2.08,1.67,1.67,6.25和2.08mL于25mL容量瓶中,混匀,用甲醇定容,得6种对照品浓度均为50mg/L的混合工作液。3.3.2牛血清白蛋白的制备准确称取7g牛血清白蛋白粉末于100mL容量瓶中,用pH7.4的磷酸盐缓冲液溶解并定容,得到1000μmol/L的牛血清白蛋白储备液,分装后于-35℃冰箱保存,备用。3.3.3蛋白溶液的配制取平底玻璃管,加适量混合工作液和800μLBSA储备液,用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释至1.5mL,作为蛋白溶液;取平底玻璃管,加适量混合工作液,用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释至1.5mL,作为空白溶液。3.4正戊醇溶液组在体积为2mL的玻璃管中加入1.5mL样品溶液,将约10cm长的聚偏氟乙烯中空纤维管洗净吹干,在正庚醇溶剂中浸泡30s,使其孔壁充满正庚醇,然后将中空纤维折成U形,在管内注入正庚醇。将中空纤维表面的正庚醇擦干,并将其浸入到药物与蛋白的混合溶液中,在900r/min搅拌速度下萃取2h,萃取结束后收集萃取相于5mL小烧杯中,并用电吹风吹干正庚醇,加入50μL甲醇进行HPLC分析。4结果与讨论4.1多孔纤维溶液的微萃取条件的选择4.1.1有机溶剂载体利用HFLPME测定药物与蛋白结合率,不仅要求中空纤维对有机溶剂有一定的亲和作用,其孔径对游离药物有良好的通透性,而且对生物大分子有极强和有效的阻挡作用。本实验考察了聚砜(UPIS503)、聚醚砜(UEIS503)、聚偏氟乙烯(MOF503)和聚丙烯(PP)作为有机溶剂载体对黄酮类化合物萃取效果的影响。根据实验结果,本实验选择聚偏氟乙烯(MOF503)中空纤维作为有机溶剂的载体。4.1.2萃取剂的选择考察了正丁醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正葵醇作为萃取剂对游离药物萃取效果的影响。结果表明,正庚醇对黄酮类化合物的萃取效果最好。4.1.3加速搅拌,提高黄酮类化合物的萃取效率本实验涉及两个平衡;一个是分析物在供相和接受相之间的萃取平衡、另一个是药物与蛋白的结合平衡。仅就LPME而言,可以增加游离药物的萃取效率。但是,加速搅拌可能破坏药物与蛋白的结合,使药物与蛋白结合率降低。本实验考察了搅拌速度为0,300,600,900,1200和1500r/min对黄酮类化合物萃取及其蛋白结合的影响。实验表明,搅拌速度为900r/min时,萃取效果较好,也不破坏药物与蛋白的结合。4.1.4萃取及蛋白结合在药物浓度一定的条件下,考察了萃取时间为30,60,90,120,150和180min对萃取及蛋白结合的影响。结果表明,萃取时间为120min时,蛋白结合及微萃取都达到平衡。故本实验萃取时间选择为120min。4.2线性回归分析取适量对照品混合工作液用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释制成0.1,0.5,1,5,10和15mg/L系列溶液,按3.4项操作。利用色谱峰面积y对分析物浓度c(mg/L)进行线性回归,结果见表1。6种药物的线性关系均良好,r>0.99。4.3-药物结合率对浓度的依赖于4.3.1黄酮类化合物与蛋白的结合率,见表1许多药物与蛋白的结合率依赖于蛋白浓度。本实验考察了蛋白浓度为0.27,0.40,0.53,0.67和0.80mol/L时,黄酮类化合物与蛋白的结合率。结果表明,随着蛋白浓度的增加,体系中游离黄酮类药物的浓度基本不变,说明药物-蛋白结合率对蛋白浓度无依赖性。4.3.2不同药物对二氢杨树莓原汁、山素、异鼠李素和杨素的影响配制不同浓度的样品溶液,按照3.4项操作,并求得药物与蛋白结合率(表2)。由表2可知,对于二氢杨梅素、山柰素、异鼠李素和白杨素,随着药物浓度增加,蛋白结合率有所降低,说明这4种药物的蛋白结合率与药物浓度有一定的依赖性;对于杨梅素和槲皮素,随着药物浓度增加,蛋白结合率基本不变,说明这两种药物的蛋白结合率与药物浓度无依赖性。4.46游离药物的作用同时服用结构相似的药物时,可能对蛋白的同一结合部位的不同或相同结合位点产生竞争或抑制,使药物蛋白结合率发生改变,体内一种或几种游离药物浓度增高。因此,本实验考察了6种药物共存或单一药物存在时,药物与蛋白结合率的差别(表3)。由表3可知,多种黄酮类药物共存和一种药物单独存在时,测得药物与蛋白结合率相差无几,说明黄酮类药物与蛋白结合时是相互独立的,不存在竞争抑制作用。故本实验可利用HF-LPME技术,同时、快速测定6种黄酮类药物与蛋白的结合率。4.5测定蛋白质结合常数和结合位的数量4.5.1bjerum图配制不同药物浓度的10μmol/LBSA溶液,按照3.4项操作。用R对log[Df]作图可得到Bjerrum图,以二氢物梅素和杨梅素为例,如图1所示。Bjerrum法测得6种黄酮类药物与蛋白结合常数和结合位点数见表4。4.5.2抗bsa的结合位点同4.5.1项配制BSA溶液,用R对R/[Df]作图(图2)或进行线性回归。Scatchard方法测得6种黄酮类药物与蛋白结合常数和结合位点数见表4。由表3和表4可知,6种黄酮类化合物与BSA的蛋白结合率顺序为:杨梅素>二氢杨梅素>山柰素>异鼠李素>白杨素>槲皮素;Scatchard法得到的结合常数顺序为:杨梅素>白杨素>二氢杨梅素>异鼠李素>山柰素>槲皮素;由Bjerrum法作图得到的结合位点数顺序为:杨梅素>山柰素>二氢杨梅素>异鼠李素>槲皮素>白杨素。可以看出,多个药物分子可能键合一个蛋白分子,也可能一个药物分子键合多个蛋白分子;杨梅素与BSA的结合率较高,结合位点数较多(2.8和2),说明杨梅素与BSA结合位点的种类数较多。分析表3和表4可知:结合常数和结合位点数同时影响药物蛋白结合率的大小。4.6药代动力学作用利用HFLPME测定药物与蛋白结合能力时,不仅要考虑中空纤维对游离药物的通透性,还应考虑中空纤维对生物大分子或结合药物的生物大分子的阻挡作用。因此,本实验考察了聚偏氟乙烯纤维对生物基质的阻挡和对药物的透过性能,结果见图3。由图3可知,聚偏氟乙烯纤维对蛋白等生物大分子有良好的阻挡效果,对药物分子透过性良好。HFLPME萃取药物与蛋白结合前后游离药物浓度发生了明显改变,因此,HFLPME选用聚偏氟乙烯纤维用于药物的蛋白结合测定。4.7不同黄酮类药物与牛血清蛋白的结合速率和萃取平衡基于HFLPME对药物与蛋白结合参数测定中存在游离药物LPME平衡和药物与蛋白结合平衡。若两平衡之间存在干扰,将直接影响实验测定结果的准确性。当萃取达平衡时,萃取相与水相萃取平衡常数K=c1/c2。游离药物微萃取达平衡时,萃取效率为:ER=n1n0×100%=c1V1c1V1+c2V0×100%(8)ER=n1n0×100%=c1V1c1V1+c2V0×100%(8)式中,n0和c0分别为药物的质量和药物的总浓度;n1和c1分别为萃取达平衡时萃取相溶液中药物的质量和药物浓度;c2为萃取达平衡时水相中药物的浓度;V0和V1分别为水相和萃取相体积。在液相微萃取中V1≪V0,式