液相色谱-串联质谱法测定人血浆中艾芬地尔

液相色谱-串联质谱法测定人血浆中艾芬地尔

爱芬吉尔是一种抗血小板聚集酶的竞争抑制剂，用于抗血小板聚集酶，改变血液中的粘度，调节血管和抗血小板聚集。其结构(结构式见图1-a)与去甲肾上腺素相似,因此可以替代后者作用于α-肾上腺素受体而没有神经递质的作用。艾芬地尔作用于大脑内的α-肾上腺素受体,使充血区到缺血区的血液重新分布,从而改善脑循环、调节脑代谢。关于艾芬地尔分析方法的报道较少。气相色谱(GC)曾被应用于动物血浆中艾芬地尔的检测。本实验中,我们以酮康唑(结构式见图1-b)为内标,采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定人血浆中的艾芬地尔的含量。并将此方法应用于11名健康受试者静脉滴注10,20,40mg艾芬地尔的药代动力学研究。1实验部分1.1试剂和血浆艾芬地尔和酮康唑购自中国药品生物制品检定所;甲醇(色谱纯)和乙酸乙酯(色谱纯)购自SKChemicals(Ulsan,Korea);甲酸和乙酸铵(色谱纯)购自Sigma-AldrichChemieGmbH;氨水(分析纯)购自重庆市西南医院试剂中心;空白人血浆购自重庆市西南医院血液中心;实验过程中使用Milli-Q超纯水。1.2高效液相色谱仪和水-环境质量仪AB公司QTRAPTM型质谱仪(应用生物系统公司,加拿大),配有电喷雾离子源(ESI);1100系列高效液相色谱仪(意大利安捷伦科技),配有G1311A泵、G1316A自动进样器和G1313A柱温箱;Reacti-ThermTM氮吹仪(Pierce);数据采集、色谱峰积分和校正采用ABAnalyst1.4软件处理(应用生物系统公司,加拿大)。1.3乙酸铵条件下柱温度采用UltraC18分析柱(150mm×2.1mm,5μm,Resteck);柱温:30℃;流动相为甲醇-6mmol/L乙酸铵溶液(pH7.40)(体积比为90∶10);流速:0.2mL/min;进样量:5μL。1.4艾芬地尔和其他离子的质谱图艾芬地尔和酮康唑的离子化采用电喷雾离子源,正离子模式。电喷雾的参数如下:气帘气(氮气)269kPa(39psi),雾化气441kPa(64psi),辅助加热气303kPa(44psi),离子源温度350℃,离子喷雾电压5400V,母离子和子离子的质谱图在选择反应监测模式(SRM)下采集。艾芬地尔和内标的去簇电压、入口电压、碰撞能、碰撞池入口电压、出口电压优化参数及其监测的离子对见表1。1)DP:declusteringpotential;2)EP:entrancepotential;3)CE:collisionenergy;4)CEP:collisioncellentrancepotential;5)CXP:collisioncellexitpotential.1.5标准溶液的配制将艾芬地尔和内标溶于甲醇配成1g/L溶液,并稀释至1mg/L作为储备液,保存于4℃冰箱中。内标的储备液用甲醇稀释至0.8mg/L。向1.0mL空白血浆中添加适量的艾芬地尔储备液,使艾芬地尔在血浆中的有效质量浓度为0.25,0.5,1,2,5,10,25,50μg/L,从而制得标准曲线样品。取空白血浆按上述方法配制含艾芬地尔0.5,5.0和50.0μg/L3个水平的质量控制(QC)样品。1.6血浆样品处理将10μL内标溶液加入到所有的质控样品和标准曲线样品(第一个空白样品除外)中,然后涡流混匀30s。所有的质控样品、标准曲线样品和待测血浆样品都经过液-液提取处理。向每个血浆样品(0.5mL)中加入0.5mL氨水(pH9.7),涡流混匀1min,然后加入4.0mL乙酸乙酯,涡流混匀1min,于3000r/min离心10min。每个样品取3.0mL有机相转移至蒸发管中,于50℃条件下用氮气流吹干。最后,样品组分用100μL甲醇溶解,涡流混匀30s。将样品转移至HPLC样品瓶中,上样5μL进行分析。2结果和讨论2.1不同子离子和内标强度的血浆样品的srm色谱图在Q1扫描模式下,艾芬地尔和内标产生了质子化的母离子[M+H]+。在谱图中可观察到艾芬地尔的主要离子为m/z326.1,内标的主要离子为m/z531.0。MS/MS谱图中,艾芬地尔强度最高的子离子为m/z308.2,内标强度最高的子离子为m/z82.1(见图2和图3)。经提取处理的空白血浆样品和含有1.0μg/L分析物的血浆样品的SRM色谱图分别见图4和图5。由于MS/MS技术的高选择性,这两个分析物之间没有观察到干扰,且两化合物的出峰处没有内源性峰的干扰,也没有观察到离子抑制现象。2.2方法的精密度和准确度、回收率和稳定性试验结果表明,在0.25~50μg/L这一浓度范围内,峰面积比(Y)与质量浓度(C,μg/L)表现出良好的线性关系。线性方程为Y=0.217C+0.0095(r=0.9995,n=8)。检测限(LOD)为0.08μg/L(S/N≥3)。对于灵敏度的测定,标准曲线的最低浓度被认为是定量限,因此艾芬地尔的定量限(LOQ)为0.25μg/L,此浓度下艾芬地尔峰面积的相对标准偏差(RSD)小于20%,标准曲线上其他各点的峰面积的RSD小于15%。该测定方法的日内精密度和准确度通过分析每个水平的5个质量控制样品来判断。结果表明,日内的准确度为97.6%~111.8%,日内的精密度(RSD)为0.04%~1.57%。实际样品测定的精密度和准确度的RSD在可接受的范围(±15%)内。结果见表2。日间的精密度和准确度通过在5d内分析15个质量控制样品来判断,其结果在精密度和准确度可接受的范围内,即实际样品测定的RSD在±15%之间。结果见表2。艾芬地尔的相对回收率通过在3个质量控制水平上(0.5,5.0,50.0μg/L)血浆样品,以提取后的色谱峰面积与相同浓度样品未经提取获得的色谱峰面积之比进行考察。结果见表2。在不同温度和储藏时间条件下考察了人血浆和储备液中的艾芬地尔的稳定性。在短期稳定性考察过程中,将保存的血浆样品解冻,保存于室温(25℃)条件下,于0,2,4,7h取样测定,然后按样品制备的方法处理。短期稳定性的测定结果(见表3)表明在正常运行的试验条件下可以接受。在长期稳定性考察过程中,将血浆样品保存于-70℃条件下,于第7d,14d,28d按样品制备的方法处理后测定,结果见表3。在反复冻融稳定性考察过程中,将保存于-70℃条件下的血浆样品反复冻融3次后,按样品制备的方法处理后测定,结果见表3。这些结果表明艾芬地尔保存在-70℃条件下是合适的,在常规的药代动力学研究中并没有出现稳定性相关的问题。2.3空白血浆的测定试验过程中并没有观察到离子抑制现象。在样品制备的过程中,测定了来自6个人的空白血浆。