环境污染物全氟碳酸与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱研究

环境污染物全氟碳酸与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱研究

全氟氰辛酸（pfoa）是一种典型的全氟化合物（pbcs）。由于c-f的共价率高，具有良好的稳定性、高表面活动性、疏水性和高油性。pfoa被广泛应用于聚合物活性剂、表面活性剂、电子工业、电子行业等行业。1973年至2004年，世界pfoa的总产量约为3600.5700吨，其中大约400.700吨。pfoa可以通过食物链传输，在动物体内产生各种毒性物质，如肝脏、神经、遗传和致癌性。在美国国家环境管理局（usa）的报告中，全氟辛酸盐被认为是“可能的（1）致癌”或“提示性致癌”。PFOA由于疏水又疏油的特点,与一般持久性有机污染物(POPs)不同,进入生物体内不易在脂肪组织中积蓄,而是优先和生物体内的蛋白质结合后发生生物蓄积.血清白蛋白是哺乳动物血浆中含量最丰富的载体蛋白,能与外源性化合物结合,起到存储和运输的作用.由于与人血清白蛋白的结构相似且廉价易得,牛血清白蛋白(BSA)常被选为模型蛋白质以研究小分子有机物与蛋白质的相互作用.本实验在模拟生理条件下,研究PFOA与BSA的相互作用,对了解PFOA在生物体内迁移、代谢及致毒机理等有重要意义.1实验部分1.1试剂和试剂仪器:F-700型荧光光谱仪(日本日立Hitachi公司),MilliporeQ超纯水系统.试剂:牛血清白蛋白(BSA)购于Fluka公司,全氟辛酸(PFOA)购自Sigma-Aldrich公司,其他所有试剂均为分析纯产品,购于国药集团上海化学试剂有限公司和南京化学试剂公司.1.2荧光光谱测定溶液配制:以0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4,含0.1mol/LNaCl)为溶剂,配制1.0×10-5mol/LPFOA溶液,同时配制4.0×10-6mol/LBSA溶液.置于4℃冰箱中保存.荧光光谱测定:10mL聚丙烯离心管中加入2mL4.0×10-6mol/LBSA溶液和2mL不同浓度PFOA稀释液混匀,在不同温度条件下(277,298和310K)反应10min后,测定荧光光谱.荧光比色皿光径为1cm,荧光扫描的固定激发波长为280nm,激发和发射通带均为5nm,扫描300~450nm的荧光光谱.同步荧光光谱扫描测定时固定激发和发射波长间隔Δλ分别为15nm和60nm.2结果与讨论2.1pfoa荧光发射因分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等残基,BSA能在紫外光激发下产生内源荧光.当激发光波长为280nm时,BSA荧光发射峰位置在340nm附近.由于无荧光活性基团,PFOA不会产生与BSA相互干扰的荧光.由图1可见,当反应体系中BSA浓度固定时,随着PFOA浓度的增加,BSA内源荧光产生有规律的猝灭,且其最大发射波长有明显逐渐蓝移现象,由此可判断它们发生了相互作用.这种作用可能造成蛋白质的荧光发色团微环境及分子构象行为变化,从而发生荧光猝灭.2.2荧光静态pfoa对bsa的荧光创造作用蛋白质荧光猝灭机理主要可分为动态猝灭和静态猝灭.动态荧光猝灭是指猝灭剂分子与荧光分子在分子运动发生碰撞而引起荧光猝灭.动态猝灭受反应温度影响大,随着反应温度升高,分子运动加快,动态猝灭加剧.各类猝灭剂的最大动态猝灭常数为2.0×1010L/(mol·s).荧光静态猝灭是指猝灭剂与荧光物质相互结合生成无荧光特性的复合物而造成荧光猝灭.与动态猝灭相比,荧光静态猝灭受反应温度影响较小.分别测定了在277,298和310K温度条件下PFOA对BSA的荧光猝灭作用.假设PFOA对BSA为动态猝灭,则采用Stern-Volmer方程可得式(1):式中:F0和F分别表示无猝灭剂和有猝灭剂时BSA的荧光强度;[Q]为猝灭剂即PFOA的浓度;KSV为荧光动态猝灭常数;Kq为荧光动态猝灭速率常数;τ0为无猝灭剂时荧光分子的平均寿命(约10-8s).由表1可见,PFOA对BSA在277、298、310K时荧光猝灭速率常数Kq分别是9.3×1012,6.8×1012,6.2×1012L/(mol·s),远大于最大动态猝灭常数为2.0×1010L/(mol·s);且随着温度升高,Kq值降低.说明PFOA对BSA的荧光猝灭是静态猝灭而非动态猝灭.2.3结合常数k当PFOA对BSA产生静态猝灭时,它们将形成新的复合物.假设PFOA在BSA上有n个相同且独立的结合位点,那么PFOA与BSA的关系可由式(2)表达:式中:F0和F分别表示无猝灭剂和有猝灭剂时BSA的荧光强度;[Q]为猝灭剂即PFOA的浓度;[P]为BSA的浓度;K为结合常数;n为结合位点数.以lg((F0–F)/F)为纵坐标(y轴),以lg(1/([Q]-(F0–F)[P]/F0))为横坐标(x轴)作图(图2),即可求出PFOA与BSA的结合常数及结合位点数.从表2可见,PFOA与BSA的结合常数在104L/mol数量级以上,结合位点数约为1,说明二者形成较稳定的1:1复合物,同时也意味着PFOA进入生物体内后,能被血清蛋白携带着在体内进行运移.此外,随着温度的增加结合常数降低,进一步验证PFOA对BSA的荧光猝灭是一静态过程.有研究表明,BSA在134和212位有2个色氨酸残基,Laura等根据Stern-Volmer二级方程曲线形状推测BSA的两个色氨酸残基都是PFOA结合位点,其中一个是强结合位点,一个是弱结合位点.然而,本文采用改进的双对数方程方法分析得到只有一个强结合位点,是否还存在一个弱结合位点,需要进一步深入研究.2.4sa的相互作用根据3个热力学公式:1)ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R,2)ΔG=-RTlnK,3)ΔS=(ΔH-ΔG)/T.分别计算出PFOA与BSA的反应焓变ΔH、自由能变ΔG和熵变ΔS.从表3中可以看出PFOA与BSA的相互结合是一个自发的(ΔG>0)、放热的(ΔH<0=过程,也是一个熵增过程(ΔS>0),因此它们的相互作用是熵和焓共同驱动完成.有机小分子与蛋白质、DNA等生物大分子之间主要通过疏水力、氢键、范德华力和静电引力等非共价力相互作用.Ross等实验总结出了小分子与生物大分子结合作用力类型的热力学规律,即:当ΔH>0,ΔS>0时,主要作用力是疏水作用力;当ΔH>0,ΔS<0时,主要作用力是氢键或范德华力;当ΔH<0,ΔS>0时,主要作用力是静电引力.由表3可见,PFOA与BSA反应的ΔH<0,ΔS>0,因此它们的相互作用力主要是静电引力.在水相中PFOA电离成酸根离子可能是静力引力产生的主要原因.然而,由于PFOA具有一定的疏水性,所以疏水力对它们相互结合也有不可忽略的作用.2.5同时采集pfoa和pfoa后的荧光特征蛋白质中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸这3种有荧光的芳香族氨基酸的荧光光谱发射峰严重重叠,常规荧光扫描光谱难以把它们的特征光谱区分,所以需要采用同步荧光光谱扫描才能对这些氨基酸进行特征扫描.同步荧光光谱是指固定激发波长与发射波长的间距Δλ,同时扫描激发波和发射波所测的扫描光谱.它可提供荧光发射基团附近微环境的变化信息.血清蛋白分子中酪氨酸残基和色氨酸残基的同步荧光特征光谱分别是Δλ=15nm和Δλ=60nm.当固定BSA浓度时,随着PFOA浓度的增大,酪氨酸残基的荧光强度被激活升高,而色氨酸残基荧光强度显著猝灭(图3),说明PFOA与BSA的结合位点接近于色氨酸残基.色氨酸最大发射波长均发生了蓝移,表明BSA与PFOA相互作用后,色氨酸附近的极性减弱,疏水环境增强,蛋白质分子结构趋于折叠状态.酪氨酸残基荧光强度被激活升高的原因可能是靠近酪氨酸附近的极性和亲水环境增强,蛋白质分子结构的趋于松散,从而使酪氨酸更容易受到紫外光激发下产生荧光效应.3荧光业光学测试和foa与bsa的相互作用3.1全氟辛酸(PFOA)对牛血清白蛋白(BSA)内源荧光具有强烈的静态猝灭作用,两者反应生成无荧光的复合物是导致BSA荧光猝灭的主要原因.3.