五灵胶囊对脂多糖诱导肝损伤的调节作用

五灵胶囊对脂多糖诱导肝损伤的调节作用

许多研究表明，tnf-i、il-6和no都是肝实质细胞和非生质细胞的病理生理变化，这些细胞和血管内皮细胞分泌il-8，共同参与肝炎和肝细胞损伤的过程。预防与修复受损肝细胞是治疗肝病的主要措施,五灵胶囊是治疗慢性肝炎中药复方制剂。对脂多糖(LPS)诱导小鼠体内细胞因子作用未见报导。我们在小鼠体内试验及大鼠枯否细胞(KC)体外培养中,观察了五灵胶囊对肝细胞释放细胞因子参与肝细胞损伤的调节作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1动物昆明小鼠,BALB/c,♂,第四军医大学动物中心提供,动物合格证号:SC×K(军)2002-05。1.1.2s-p超敏试验剂丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酯酶(ALP)试剂盒(北京中生北控生物科技股份有限公司);兔抗-CD14、兔抗-TNF-α、兔抗-NOSⅡ(iNOS)、兔抗-NOSⅢ(eNOS)一抗(武汉博士德生物工程有限公司);S-P超敏试剂盒(福州迈新生物技术有限公司);肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)125I放免试剂盒(北京北方生物技术研究所);脂多糖(LPS),USA.Sigma公司;RPMIMedum1640培养基(批号:1080385USA.Gibco);五灵胶囊(第四军医大学西京医院药剂科提供,批号:20040122),称取五灵胶囊2g,蒸馏水加热溶解至10mL,设置3个浓度(2.0,1.0,0.5g·kg-1)供试验。1.2不同给药剂量对小鼠血清学指标的影响昆明小鼠40只,体重(25±2)g,♂,在温度(22±3)℃、湿度60%～70%的实验室饲养3d后进行试验。小鼠随机分成5组,正常组、LPS组、五灵胶囊2.0,1.0,0.5g·kg-13组,正常组和LPS组分别ig蒸馏水10mL·kg-1,五灵胶囊3个剂量组分别ig相应剂量,各组小鼠每天ig给药一次,连续给药4d,第4天给药2次,2h后正常组尾静脉注射生理盐水2mL·kg-1,其余各组小鼠按体重尾静脉注射LPS3.5mg·kg-1,小鼠禁食自由饮水,12h后小鼠眼眶取血并分离血清,测定ALT,AST,ALP;迅速取肝脏,固定,石蜡包埋、切片常规脱水,参照说明书的操作步骤进行免疫组化学染色:SP法染色一抗稀释比CD14、TNF-α(1∶100),阴性对照片采用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗,DAB系统显色,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。结果评定:标本无明确阳性反应者为阴性,在40倍镜下以Miaspro图象分析系统(四川大学计算机图象图形研究所)程序扫描染色阳性细胞和阴性细胞面积,每只小鼠肝组织扫描5个视野,每组共扫描25个视野,结果以阳性细胞率表示。1.3细胞培养及分组按高春芳等介绍方法,取传2-3代纯化KC用200mL·L-1小牛血清1640培养液调整细胞密度1～108/mL加细胞悬液1mL于含有8×8mm盖玻片的24孔培养板内,置37℃,50mL·L-1CO2孵箱内培养使细胞长至单层。分组:正常组、模型组、五灵胶囊组(0.1mg·mL-1),(n=5)。正常组、模型组加完全培养液1mL,五灵胶囊加含有0.1mg·mL-1五灵胶囊完全培养液1mL,继续培养24h,弃除上清;正常组加完全培养液,模型组、五灵胶囊组加含60μg·L-1LPS的培养液1mL,继续培养10h,收集上清,-80℃冻存;各孔细胞爬片用0.01mol·L-1pH7.4的PBS缓冲液洗涤2次,置4℃丙酮固定10min,同上法进行免疫组化染色。1.4灌胃静脉给药、小鼠血清学Balb/C小鼠40只,体重(20±2)g,雄性,同上述相同条件饲养3d,随机分4组,正常组、LPS组、五灵胶囊1.0和0.5g·kg-1组,每组10只。正常组、LPS组灌胃给予蒸馏水10mL·kg-1,五灵胶囊2组分别ig给药相应剂量,连续给药5d,末次给药2h后,正常组尾静脉注射生理盐水2mL·kg-1,余下3个组小鼠均尾静脉注射LPS3.5mg·kg-1,小鼠禁食自由饮水,12h后眼眶取血并分离血清,备用。同时立即取肝脏制备10%肝匀浆,10000r·min-1离心15min,取上清,125I放免法测定血清与肝匀浆IL-6,IL-8,TNF-α含量。1.5统计学处理应用SPSS10.0统计软件,所测数据以x¯±sx¯±s表示,表2,3数据采用Kruskal-Walls秩和检验,余者采用AVOVA行单因素方差分析,以α=0.05为检验水准。2结果2.1活性下降p>0.1血清酶活性与正常组比较:模型组ALT,AST活性升高,ALP活性下降(P<0.01);与模型组比较,五灵胶囊2.0,1.0g·kg-1组有降低AST活性作用(P<0.05〉,五灵胶囊2.0g·kg-1组可降低ALT活性(P<0.05),见表1。2.2肝组织tnf-,cd14表达情况免疫组化结果显示:正常组肝小叶内少量肝细胞及枯否细胞呈CD14阳性染色,定位于胞浆;TNF-α阳性染色弥散分布于整个小叶,定位于胞浆;iNOS阳性表达与TNF-α相似,定位胞浆或核膜;小叶内eNOS阳性染色细胞散在分布,定位胞浆。模型组肝组织TNF-α,CD14和iNOS表达阳性率均高于正常组(P<0.01)。五灵胶囊3个剂量组TNF-α,CD14阳性表达率在肝组织损伤区低于模型组(P<0.05)。3个剂量组iNOS阳性率高于模型组(P<0.01)。见表2。2.3免疫组化阳性染色结果TNF-α,CD14,iNOS,eNOS定位于KC胞浆,各试验组免疫组化阳性染色结果以:弱阳性计1分、阳性计2分、强阳性计3分。见表3。2.4两组血清中il-6,il-8,tnf-含量比较模型组血清与肝匀浆中IL-6,IL-8,TNF-α高于正常组(P<0.01),正常、五灵胶囊两组血清与肝匀浆中IL-6,IL-8,TNF-α含量均低于模型组(P<0.01),见表4,表5。2.5不同剂量五灵胶囊对肝说血清素-期肝清胞的影响镜检:正常组小鼠肝小叶结构清晰,内皮细胞及枯否细胞未见增生,可见少量淋巴细胞。模型组肝小叶结构紊乱,汇管区可见大片肝细胞嗜酸性变,内皮细胞及枯否细胞增生肥大,可见大量炎细胞浸润。与模型组比较,五灵胶囊2g·kg-1组肝小叶结构大致正常,内皮细胞及枯否细胞增生肥大,可见炎细胞浸润、聚集;五灵胶囊1g·kg-1组肝小叶结构紊乱,中央静脉周围肝细胞空泡样变、浊肿,汇管区扩张,内皮细胞及枯否细胞增生肥大,可见炎细胞浸润;五灵胶囊0.5g·kg-1组肝小叶结构模糊,汇管区扩张,中央静脉周围肝细胞浊肿,嗜酸性变,肝细胞再生增多,内皮细胞及枯否细胞无明显增生,伴炎细胞浸润。3对lps诱导肝损伤作用LPS诱导肝损伤是通过激活KC大量释放TNFα,IL-6,IL-8等促炎细胞因子所致。结果显示小鼠注射LPS后,血清ALT,AST酶活性显著升高,而ALP水平显著降低,ALT,AST酶活性显著升高与血清及肝匀浆中TNFα,IL-6,IL-8含量上升相平行。LPS和TNFα刺激肝细胞分泌趋化细胞因子IL-8,IL-8水平上升与肝组织损伤的程度成正比,免疫组化显示肝组织内TNFα,iNOS,eNOS阳性率明显上升,病理组织学观察:模型组肝小叶结构紊乱、大量炎细胞浸润、内皮细胞及KC增生肥大、汇管区扩张,组织病理学结果与免疫组化学显示肝组织内TNFα,iNOS和iNOS阳性率上升一致,与文献慢性肝炎患者血清与组织中TNF-α,IL-6,IL-8水平上升并与肝损伤程度呈正相关的结果相同,提示LPS诱导肝损伤是通过激活KC大量释放TNF-α,IL-6,IL-8等促炎因子所致。五灵胶囊降低LPS导致肝损伤组织ALT,AST酶活性,可使小鼠血清和肝匀浆中TNF-α,IL-6,IL-8水平下降,组织学观察肝组织损伤程度也低于模型组,提示五灵胶囊抑制各种诱因诱导肝实质与非实质细胞释放大量细胞因子是治疗肝损伤机制之一。CD14为LPS在KC胞膜上效应性受体,众多研究表明,LPS介导KC激活释放细胞因子有CD14依赖性和非依赖性途经,LPS在脂多糖结合蛋白(LBP)存在条件下与KCCD14结合,形成复合物,体内、外试验表明LPS上调KC表面CD14表达量则肝损伤明显地加重。五灵胶囊能降低CD14表达,抑制LPS诱导KC释放炎症因子,有效干预LPS诱导的炎症反应,这是该药抑制LPS所致肝损伤的作用机制,组织学结果也为这结论提供了支持。近年研究表明LPS诱导肝细胞和KC释放NO,NO在各种原因所致的肝损伤中参与肝细胞损伤过程。LPS诱导iNOS生成量增加,活性增强,引起肝细胞损伤。试验显示五灵胶囊激活iNOS表达,2和1g·kg-1剂量组iNOS表达量均高于模型组,eNOS表达量与模型组相似,与我们早期试验结果相似,五灵胶囊激活肝细胞生成iNOS作用,自然就降低该药对抗L