白组织培养研究进展

白组织培养研究进展

白蜡树是白蜡树科的一种多年生草本植物，也被称为“白蜡树”。它也被称为冰子、贝壳、贝壳等。其干燥块茎,具有收敛止血、消肿生肌等功效,常用于治疗咯血、吐血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等。已有研究表明白芨具有抗菌和抗肿瘤的作用。白芨不仅用于中医临床,也广泛应用于日化产品,如化妆品、高级陶瓷制造、纺织、橡胶生产等。随着白芨应用的不断拓展,其需求量不断增加。然而,由于其种子发育不完全,在自然条件下很难正常萌发,主要靠块茎繁殖,繁殖系数有限,因而白芨的产量很难满足产业的需求,致使其价格连年攀升。为此,无菌快繁就成为繁殖白芨的一条有效且重要的途径。近年来,白芨组培研究的报道显著增多,主要集中在种质资源的研究和种苗的繁育方面。现就近年来白芨组织培养的相关研究进展进行综述,并对今后的研究方向提出建议,旨在为白芨的快繁研究、工厂化育苗及炼苗移栽提供一定的参考。1白组织培养中构建完善的分子体根据植物细胞全能性的原理,适宜的条件下,每个植物细胞都具有发育成完整植株的能力。根据实验的目的和要求不同,研究者在进行白芨组织培养时分别选用了种子、侧芽和幼根做外植体,最终均建立了无菌体系。[5-10,12-14]1.1种子的无菌发芽研究1.2白侧芽的制备从文献看,茎尖是最早也是使用频率最高的兰花外植体,由于茎尖数量有限,以侧芽做外植体的应用相当广泛。[9,10]茎尖作为外植体较适合于复茎性兰花,如石斛兰、大花蕙兰、文心兰等,但对于一些单茎性兰花,用茎尖作为外植体,则有可能丧失母株,人们更倾向于用侧芽做外植体。而且在此过程中,还可以避免实生苗在培养过程中容易产生变异的缺点;其次,在选择材料时可以有效地剔除病株和变异株,并且侧芽恢复生长快,形成丛生芽需要的时间比较短。石云平等以白芨侧芽为外植体继代培养后得到了丛芽,摸索了侧芽灭菌的方法,得出:用0.2%升汞消毒灭菌8min的效果较好,同时还得出侧芽是白芨进行组织培养的适宜外植体。田英翠以白芨幼根为材料,添加不同浓度水平的生长调节剂成功诱导出原球茎并进行分化培养。利用叶片作为外植体诱导形成愈伤组织,再分化形成丛芽,是植物快繁的另一途径。但是,这种途径形成的幼苗变异率较高,更多地是应用于植物育种。刘军凯选用9月份的白芨叶作为外植体,进行愈伤组织的诱导,结果表明幼叶上无法诱导出愈伤组织。这与石云平的研究结果一致:叶片诱导愈伤组织较困难,诱导率只有3.3%。因此,叶片不适合作为愈伤组织诱导的外植体。2植物生长调节剂、添加剂的选择和人工种子的研究2.1植物生长调节剂培养基中植物生长调节剂对植物细胞分裂、诱导器官形成和次生产物的合成都具有重要作用,生长调节剂的浓度和比例关系决定了植物分化的方向。单芹丽等以石斛种子为材料,研究3种植物生长调节剂6-BA、NAA、IBA对铁皮石斛种苗生长发育的影响,结果表明,植物生长调节剂的种类和浓度对铁皮石斛种苗的繁殖、生长速度影响差异显著。贺佳在基本培养基MS中分别添加不同浓度的细胞分裂素和生长素,共8个处理,筛选出适宜愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA1.0~1.5mg/L+NAA0.2mg/L。少数研究表明:诱导无菌苗增殖的最适宜组合是Fast培养基+TDZ5.0mg/L+NAA0.05mg/L+肌醇50mg/L,无菌苗增殖倍数达到了7.3倍。朱玉球得出,较低浓度水平的BA(0.5mg/L)利于原球茎的保存和增殖,而中等浓度水平的BA(1.0mg/L)利于原球茎的增殖和分化。石云平的研究表明:以MS为基本培养基,添加不同浓度的BA和2,4-D,有利于愈伤组织的诱导、增殖和分化。2.2不同有机添加物对种子管理生长的影响在植物组织培养中,细胞的生长受多种外界条件的影响,如调整培养基中营养成分的配比,常使用添加剂,如椰子汁、香蕉泥、马铃薯汁、魔芋粉、活性炭等。不同的培养目的需要不同的添加剂,而不同的添加剂对培养物的生长分化及体内生理生化变化起着至关重要的作用。谢寅峰以霍山石斛试管苗为材料,研究了100~300g/L的土豆泥、香蕉泥、白萝卜汁3种有机添加物对霍山石斛试管苗生理特性的影响。结果表明,不同浓度的3种添加物均显著提高了霍山石斛试管苗的生物量、叶绿素和可溶性糖含量,以土豆泥效果最佳。赵漫丽的研究表明:培养基中加入适量活性炭有利于种子的萌发,在增殖培养中,加入适量豌豆粉,可显著提高增殖率;在生根培养基中,加入香蕉泥利于白芨苗的生根,且根系健壮,提高了移栽成活率。同时,袁宁的研究也表明在添加香蕉泥的培养基中,白芨的生根效果较好。综合上述研究发现:白芨组织培养最常选用的激素是6-BA和NAA或2,4-D。为提高其增殖率和无菌苗的质量,香蕉泥和活性炭常被加入生根培养基中,而魔芋粉和椰子汁是增殖培养中常用的添加剂。2.3白种子制备体系李伟平等以白芨种子为材料,研究了白芨人工种子的胚乳及种皮基质配比等,初步探索了白芨人工种子的制备体系。张桂芳以铁皮石斛原球茎为包埋体制作人工种子,考察胚乳、种皮组分对种子萌发及成苗的影响,并得出在人工胚乳中添加10g/L的SiO2有助于提高成苗率。3野生苗种的采挖和栽植针对生根培养与炼苗移栽的研究只在白芨的快繁体系中略加涉及,很少有专门报道白芨生根培养的文献。石晶在白芨属植物资源与利用中提出白岌选育研究技术条件不成熟,白芨组培苗的栽培,没有试行成功。几乎所有企业或农户目前所栽培的白芨都来源于野生种苗的采挖。但在众多文献中:朱玉球和余朝秀的研究同时表明:当试管苗长至3~4cm时,经适当的处理后,保持一定的湿度,成活率可达95%以上。张燕的研究也得出:炼苗基质为腐殖土和蛭石(1∶1),成活率可达90%以上。袁宁应用60%腐叶土+30%珍珠岩+10%素红土能使移栽的成活率达到90%以上。邹娜的报道表明:无菌苗进行壮苗生根培养后,成活率可达到96%以上。这与石晶的结论差异较大。4白组培生产工艺研究及补充培养基的建设目前,由于白芨组织培养的研究大多局限于基础研究:如外植体选择、灭菌时间和方法、基本培养基和激素浓度及添加剂的影响、生根培养几个方面。而同是兰科石斛属的研究范围则较为广泛:种质资源筛选、培养条件筛选、根部共生菌的研究分离、细胞培养研究等都有大量文献报道。关于白芨属遗传多样性方面的研究就更少,仅和志娇利用简单重复序列区间(ISSR)标记对白芨属白芨、小白芨、黄花白芨进行了遗传多样性的研究并构建了系统树,结果表明:不同地理位置采集到的这3种白芨样品种内和种间的遗传亲缘关系有明显的差异。鉴于白芨目前的市场现状和栽培现状,如何提高组培苗的品质、缩短白芨的繁殖周期、制定出科学合理的组培生产工艺是亟待解决的问题。要实现白芨工厂化育苗和GAP种植,使实验研究更有效地指导生产,需要更多的有关白芨组培生产工艺的研究来填补这一缺憾。另外关于白芨人工种子的研究存在很大空缺,白芨组培苗与传统栽培苗的成分含量及药效是否相同,在显微结构及形态发育方面的比较研究也还是空白。为了更深入地了解白芨的栽培生物学特性,更需要用分子方法对其遗传稳定性做大量的研究,补充栽培学方面的不足。大多数的实验研究采用种子作为初代培养材料,张燕以白芨种子为培养材料,对白芨种子无菌非共生萌发过程中原球茎发育进行了研究,结果表明:种子萌发的最适培养基为1/2MS+1.0mg/LNAA。袁宁等用白芨种子无菌播种研究表明:种子成熟度对种子的萌发影响较大,促进种子萌发的培养基为1/2MS+1.0mg/L6-BA。叶静的研究结果表明:1/2MS+1.0mg/L6-BA+1%活性炭最适合白芨种子萌发。根据上述报道,尽管很多研究在种子萌发过程中采用的激素种类和浓度有差异,但最终采用1/2MS为基本培养基都获得了丛芽,形成了幼苗。由此可见,激素对白芨种子的萌发影响不大,这与郭顺星的研究结果一致:白芨胚的薄壁细胞贮存大量的蛋白质、油脂和碳水化合物,可作为种子萌发的营养成分。影响种子萌发的最主要因素是种子的成熟度和种子萌发时的湿度。因此,种子萌发时,采用1/2MS为基