绿萝组培快繁技术要点研究

绿萝组培快繁技术要点研究

0国外培养绿萝的研究进展【研究意义】秀丽草，又名金娘、魔鬼藤、金藤等，是天南星科多年生多年生草本植物，发生在印度尼西亚的索罗门群岛（王庆莲，2002）。它通常生长在岩石和树干上，成为一种巨大的观赏藤本植物，在中国南方各地均有种植。绿萝耐阴性强，终年常绿，叶面有较厚的角质层，能适应室内干燥的环境条件，是优良的室内观叶植物。此外，还能吸附和去除室内空气中的甲醛、苯、三氯乙烯等污染物，是天然的“空气净化器”，越来越受到人们的喜爱，具有较大的市场前景。因此，研究绿萝快速繁殖技术特别是组织培养，对进一步研究其遗传特性和新种质的培育具有重要的理论与实践意义。【前人研究进展】我国自1989年开始对绿萝组培进行研究（李斌麒和赵月芬，1989；林德辉，1989；鲁雪华，1990；郭英和梁国鲁，2002；张兴翠，2004）。近十年来，有关绿萝组培的研究渐多。王越铭和李康（1998）以绿萝茎尖和茎节为外植体，筛选出诱导芽分化培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L，丛生芽培养基为MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.2mg/L，生根培养基为MS+NAA0.01mg/L。黄凤兰等（2004）采用两种途径对小叶绿萝进行组织培养：愈伤组织途径以不带节的茎段为外植体最佳，诱导愈伤培养基为1/2MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.4mg/L+2,4-D0.8mg/L，胚状体的分化培养基中不加入生长调节物质的效果最好；增强腋芽生枝能力途径以带节的茎段为外植体最佳，诱导丛生芽的培养基为1/2MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L，生根培养基为1/2MS+NAA0.05mg/L。范俊岗（2009）以幼嫩叶片为外植体，较系统地研究了绿萝离体再生技术体系，发现外植体愈伤组织最佳诱导培养基为MS+TDZ0.2mg/L+NAA0.5mg/L，不定芽最佳诱导培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L，不定芽增殖最适培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L，生根培养基为1/2MS+NAA0.1mg/L+IBA0.2mg/L。陈广玉（2011）以绿萝叶片、带节茎段为外植体进行组织培养，成功获得再生植株，并建立了快速无性繁殖体系，结果显示，最适愈伤组织诱导的外植体为叶片，最适愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L，最适增殖培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L；采用生根培养和水培两种途径对绿萝进行移栽，最适生根培养基为1/2MS+NAA0.1mg/L。【本研究切入点】至今为止，人们对绿萝已进行了大量研究，国内主要集中在其栽培技术方面，有关其组织培养的研究虽较多，但仍处于起始阶段。【拟解决的关键问题】以绿萝叶片及不带节的茎段为外植体，研究其组培快繁技术要点，旨在为绿萝的再生体系建立提供理论基础，为绿萝的工业化生产提供技术支持。1材料和方法1.1试验材料供试材料选自广西林业科学院花卉研究所种植的绿萝（Scindapsusaureus），取其叶片和无节茎段作为外植体。1.2测试方法1.2.1生长情况观察将绿萝叶片及无节茎段先用中性洗涤剂洗涤5～10min后用流水冲洗30min，然后在超净工作台上，用75%酒精灭菌30s，无菌水冲洗3～4遍，再用0.1%HgCl2灭菌10min，无菌水再冲洗3～4遍。将叶片切成0.5cm×0.5cm小块、茎段切成0.5～1.0cm小段接种在以MS为基本培养基、添加不同浓度激素的培养基上（表1）。每天观察其生长情况，20d后统计愈伤组织生长状况。培养条件：温度（25±1）℃，每天光照12h，以下培养条件均同。出愈率（%）=产生愈伤组织的外植体数（个）/接种外植体数（个）×1001.2.2愈伤组织分化将切割好的愈伤组织块接入以MS为基本培养基、添加不同种类和浓度激素的培养基中（表2），以后每天观察愈伤组织变化，40d后统计愈伤组织分化数以及不定芽数。愈伤组织分化率（%）=产生不定芽的愈伤组织数（个）/接种愈伤组织数（块）×100增殖系数=产生不定芽数（个）/接种愈伤组织数（块）1.2.3生根培养将生长健壮的无根小苗转接到生根培养基中（表3）,20d后观察生根情况。1.2.4苗苗栽植后放养将已生根的组培苗置于室温并打开瓶盖进行炼苗2～3d，然后将苗取出，冼净残留培养基，用1000倍的多菌灵溶液浸泡后移栽到透气性良好的基质中，浇透水，20d后统计移栽成活率。2结果与分析2.1外植体诱导分离的比较在研究过程中发现，愈伤组织首先在外植体的切口边缘处逐渐产生。由表1可知，在无激素的培养基上，两种外植体的出愈率均为零，表明在绿萝愈伤组织诱导中，激素6-BA和NAA是必需的。在不同培养基上，随着NAA浓度的增加，叶片愈伤组织产生的时间缩短，但茎段愈伤组织产生的时间无明显变化；随着6-BA浓度的升高，叶片和茎段愈伤组织产生的时间均呈现缩短趋势。对不同外植体的诱导结果进行比较，发现叶片出愈率均低于茎段，且需要的诱导时间较长；茎段的出愈率最高可达100%，而叶片最高为66%；茎段产生愈伤组织所需时间最短为11d，而叶片最短时间为18d，说明叶片产生愈伤组织的能力不及茎段。此外，在不同培养基中，产生的愈伤组织质地也有所不同，大部分培养基均产生褐色愈伤组织。当以叶片为外植体时，其在培养基MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L的出愈率最高（66%），产生愈伤组织的时间最短，为18d，愈伤组织为浅绿色。当以茎段为外植体时，培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L的出愈率最高，达100%，出现愈伤组织的时间短，为12d，愈伤组织质地表现较好，没有褐色愈伤组织。综上所述，以叶片和茎段为外植体，均能产生愈伤组织，但茎段产生愈伤较快；叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L，茎段诱导愈伤组织的最佳培养基均为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L。2.2培养基浓度对愈伤组织增殖的影响由表2可以看出，适量的细胞分裂素和生长素配比对愈伤组织的分化有明显的作用。在未添加任何激素的培养基上，愈伤组织分化率很低，叶片和茎段分别为12%、15%，增殖系数也低，分别为1.7和2.2；但在添加不同激素的培养基上，不论何种外植体，愈伤组织的分化率均达到100%，且增殖系数较高。不同激素水平对绿萝愈伤组织分化的影响主要表现在增殖系数和产生不定芽的最短时间以及不定芽的长势上。在添加一定浓度的NAA或IBA条件下，大部分处理愈伤组织增殖系数随培养基中6-BA浓度的增加呈上升趋势，而不定芽产生时间呈减少趋势，但不定芽长势变弱；在一定6-BA浓度条件下，添加较高浓度NAA或IBA更有利于提高愈伤组织增殖系数，缩短不定芽产生时间，不定芽长势也较好。培养基添加2.0mg/L6-BA与0.2～0.3mg/LNAA的组合（培养基6和7）及2.0mg/L6-BA与0.3mg/LIBA组合（培养基16）可获得较高增殖系数、较短的不定芽产生时间和较好的不定芽长势；3.0mg/L6-BA与0.2～0.3mg/LNAA的组合（培养基9和10）及3.0mg/L6-BA与0.2～0.3mg/LIBA组合（培养基18和19）虽也可获得较高增殖系数、较短的不定芽产生时间，但不定芽长势较弱。其中，在培养基10即添加3.0mg/L6-BA、0.3mg/L组合上，叶片愈伤组织增殖系数最高，为10.5，产生不定芽所需时间最短，为23d，不定芽长势较弱；茎段的增殖系数为11.2，产生不定芽的时间最短为12d，但不定芽长势一般。而在培养基6上，叶片愈伤组织的增殖系数为10.2,24d能够产生不定芽，长势健壮；茎段愈伤组织的增殖系数最高，为11.5，茎段不定芽产生需要14d，芽的长势健壮。叶片在培养基7、8、17上产生不定芽所需时间虽然也只需24d，但不定芽长势一般，不利于后期的生根以及移栽。综上所述，两种外植体进行继代培养的最佳培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L，增殖系数高，产生不定芽时间短，长势也好。2.3naa浓度对植株生长和根系老化的影响根的好坏不仅影响移栽的成活率，对植株后期的生长也有直接影响。根系粗壮、长度适宜、毛细根多有利于移栽成活。从表3可以看出，不论是否添加了NAA，绿萝都能100%生根，但不同培养基中根生长情况有较大差异。接种在1/2MS培养基上的植株，根少且细，植株生长一般，而接种在含有NAA培养基上的植株，随着NAA浓度的升高，植株生长转好；当NAA浓度为0.20mg/L时，植株长势好，根多、粗壮，须根也多，根白色，根尖为白色说明正处于细胞分裂旺盛期；但NAA浓度超过0.20mg/L后，植株长势又开始变差，特别是根的颜色明显发黄，根系出现老化的趋势。可见NAA对绿萝生根有直接影响：在一定NAA浓度范围内，随着其浓度升高，促进植株生长的作用明显，当NAA超过一定浓度时，就会对其生长产生抑制作用，绿萝的最适生根培养基为1/2MS+NAA0.2mg/L。2.4集体苗移植将获得的绿萝生根组培苗进行炼苗移栽，保持适当的温度和湿度，20d后，成活率可达98%。3汉国时期愈伤组织的诱导与分化本研究结果表明，绿萝叶片和茎段两种外植体均能产生愈伤组织，但茎段较叶片产生愈伤快，产生不定芽也快，可见进行绿萝组培以茎段为外植体为宜。然而利用茎段为外植体对母株伤害较大，利用叶片等则可减少对母株的损伤。在实际生产过程中，特别是工厂化育苗过程中，选择外植体要考虑多方面的因素，如果材料较多，可以采用茎段；如果材料稀缺、珍贵，则宜选择叶片为外植体。在诱导愈伤组织过程中，可以观察到愈伤组织发生了褐变。褐变的原因较多，外植体材料的生理状态、基因型、同一基因型的不同栽培条件、营养状况、生长部位和大小、培养基的成分、外源激素的含量及比例、培养条件等都会对褐变有影响。Kahn(1977）、Mager和Harel(1979）等研究表明，苹果和梨的组织褐变与其酚类物质含量密切相关。张朝军等（2005）在棉花胚性愈伤研究中认为，氮源配比不合适是褐变现象的主要诱因，与KT、6-BA、IAA等激素关系不明显。褐变在组培过程中普遍存在，影响植物的正常生长，严重时可导致植株死亡。因此预防褐化是组培成功的关键环节。防止褐变的措施一般包括选取适当的外植体，选择合适培养基和培养条件，或者在培养基中附加Vc、活性炭等，对减轻和防止褐变有明显的效果。本研究尚未对绿萝组培的褐变进行研究，今后可进行深入研究。在组织培养中，常利用细胞分裂素和生长素来刺激和诱导愈伤组织的诱导与分化，本研究以6-BA、NAA和IBA3种激素不同浓度水平调控愈伤组织的诱导及分化，提高了植株再生频率，建立了完整的无性系。愈伤组织途径是一个较为漫长的过程，且容易引起变异，不能保持植株原有的优良性状。而通过不定芽途径建立离体快繁体系，不但节省了时间，而且保持了植株原有的优良性状。因此，通过