蔬菜叶片中叶绿体提取与鉴定

蔬菜叶片中叶绿体提取与鉴定

叶片绿体dna（ctsda）的结构和功能对提高作物的外观和光合效率具有重要意义，有助于研究细胞。自20世纪70年代Kolndener和Towari首先成功提取了豌豆ctDNA以来,ctDNA的研究开始受到广泛注意,已对多种豆科、禾木科植物等进行了研究,提供了许多从不同植物中提取ctDNA的方法。由于绿色蔬菜的细胞组织结构一般比较肥大、脆弱、含有较多汁液、丰富的糖类、酸类、碱类及酚类等物质,所以分离其叶绿体DNA时,在破碎细胞的过程中容易受到核DNA、线粒体DNA及一些酚类等物质的污染和影响,从而使前人方法的应用受到一定制约和一些条件限制。本试验在前人研究基础上通过改进差速离心与密度梯度离心,选用适当的有机试剂提取,为从绿叶蔬菜中提取ctDNA提供了一种可供参考的方法。1材料和方法1.1dy-型电泳法供试材料为新鲜蔬菜,菠菜、韭菜叶片,购于陕西省杨凌示范区市场。仪器有日立SCR20BC高速离心机,日立55P-72超速离心机,BeckmanUV-7紫外分光光度计,DYY-Ⅲ型电泳仪。试剂为A液:0.3mol/L蔗糖,50mmol/LTris-HClpH8.0,10mmol/LEDTA,5mmol/L巯基乙醇,0.1%BSA,1.0%PVP,10mmol/LMgCl2。B液:0.3mol/L蔗糖,50mmol/LTris-HClpH8.0,3mmol/LEDTA,5mmol/LMgCl2。C液:50mmol/LTris-HClpH8.0,10mmol/LEDTA。1.2叶绿体dna的纯化叶绿体的提取分离取新鲜蔬菜叶片200g洗净,暗处理48h,加入2.5倍体积缓冲匀浆液A,于组织捣碎机内匀浆5次,每次10s,用4层纱布过滤,收集滤液,4℃下300×g离心2min,收集上清,1500×g离心10min,取沉淀。用B液悬浮。将以上过程重复1次。叶绿体纯化制备参考张志良,印莉萍等的方法,按阶梯型密度梯度在离心管中按至下而上的顺序铺上2mol、1.8mol、1.5mol、0.8mol四层蔗糖溶液,在梯度项端加上3~5mL叶绿体粗提取液。4℃下30000×g离心50min。在1.8mol与1.5mol的界面间,出现一个明显的绿色区带(图1)。用带直角弯针头的注射器从叶绿体区带中慢慢地将叶绿体区带吸出(即纯化的叶绿体)。加B液洗涤,1500×g离心10min,除去蔗糖。沉淀为纯制剂悬浮于10mLB液。取一小部分用于镜检的样悬浮于B液(4℃下存放),显微观察(图2)。叶绿体DNA的提取纯化参考T.Manitis,岳强等的方法,用50μg/mLDNaseⅠ处理叶绿体悬液,37℃1h,加入EDTA使终浓度为20mmol/L,除核DNA的污染。用酚/氯仿(1∶1)5000r/min抽提一次,吸取水相。加入10%SDS使终浓度为2%,加入蛋白酶K至50μg/mL,于37℃水浴保温2h。加入等体积的酚,在三角瓶中轻轻旋转15min,5000r/min离心5min,吸取水相加入等体积的酚/氯仿(1∶1)混合15min后5000r/min离心5min。加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)摇动10min后,5000r/min离心5min。吸取上层水相。重复此步骤直至中层无变性蛋白质。加等体积水饱和乙醚反应5s,8000×g离心3min,吸取上层乙醚后置65℃水浴10min,除乙醚。取水相,加MgCl2到10mmol/L和1/10倍体积3mol/LNaOAC后,再加入两倍体积冷乙醇,置-20℃冰箱过夜。5000r/min离心10min后,将沉淀溶于少量C液中加入固体NaCl使终浓度为50mg/mL,于-20℃放置1h后,10000×g离心5min,收集上清。加入RNase使终浓度为50μg/mL,37℃水浴保温1h。重复酚、氯仿/异戊醇脱蛋白步骤,收集上清液。加入MgCl2到15mmol/L和1/10倍体积3mol/LNaOAC,再加入两倍体积冷乙醇,置-20℃冰箱过夜,15000r/min离心30min,收集沉淀1mL75%乙醇中-20℃保存。1.3ctcda浓度与纯度按常规方法用紫外分光光度计定容测定ctDNA在260nm和280nm处吸光度值(表1)。计算ctDNA浓度与纯度。取5μL所得ctDNA溶液,用1%琼脂糖电泳,0.5×TAE缓冲液,80V下电泳45min,紫外光观察并照相(图3)。2结果与分析2.1叶绿体层的划分从图1可见,离心管内梯度中可看到4条明显区带,顶层区带L为脂质层,中层上部D为破碎叶绿体,中层下部C为叶绿体层,下层区带P为质体层;其他为密度高的淀粉粒,细胞杂质沉淀到离心管底部。其中叶绿体层数量比较多,但中上部仍存在较多破碎叶绿体。叶绿体与细胞碎片和杂质得到良好分离(图1)。2.2光学显微镜下的观察纯化后叶绿体为椭圆或卵形,无细胞碎片和其他细胞器(图2)。图2放大倍数为16×100(油镜观察)、×8倍尼康数码照相机照相。2.3紫外分光光度计tcdaA260估算DNA提取量约200~300μg/200gctDNA纯度按A260/A280值接近1.8(表1)。2.4叶绿体dna提取用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取出来的ctDNA,得到清晰整齐的条带(图3、4)。3dna提取高等植物中一般绿色蔬菜叶片细胞含有较多汁液,结构比较脆弱,如果需要的材料数量较多适宜选用组织捣碎法。一般细胞核沉降系数为7×106s左右,密度为1.3g/cm3。线粒体沉降系数S值为1~1.7×104s,密度1.18~1.19g/cm3。而叶绿体密度为1.21g/cm3,S值3×105。质体密度1.22g/cm3。据此正确地选择离心力,选用2~3循环差速离心,结合2mol、1.8mol、1.5mol、0.8mol蔗糖密度梯度离心,就可较好地除去细胞核nDNA、线粒体以及细胞碎片和破碎细胞的膜类、线粒体等,获得纯度较高的叶绿体。而这正是获得的纯度较高的ctDNA的关键之一。在叶绿体悬浮液中使用DNaseⅠ,用以除去nDNA及mtDNA污染。在ctDNA悬液中使用RNase,水解残存的RNA。使用过这些酶制剂后应该对其及时做灭活、清除处理。叶绿体通过化学破膜蛋白酶处理后,使用蛋白酶K降解变性蛋白;酚与氯仿有机溶剂除蛋白质,一般需重复3~5次以上,直至有机相与水相之间无变性蛋白。以保证样品纯度。大多数高等植物叶绿体DNA长度为120~180kb左右。为了保证获取DNA的效率,使用乙醇沉淀前最好使溶液中MgCl2浓度达