木本植物组培中褐化的产生及影响因素

木本植物组培中褐化的产生及影响因素

黄褐色，又称苯酚污染，是指植物组的培养中的外植体和培养物发生棕棕色死亡的现象。褐化严重影响了外植体的脱分化和培养物的再分化进程,是组培中存在的三大难题之一,也是木本植物组织培养能否取得成功的决定性因素。褐化发生与外植体体内酚类物质的含量呈正相关。而酚类的糖苷化合物是木质素、单宁或色素的合成前体,因此,木质素、单宁或色素含量高,酚类化合物含量就高。故木质素、单宁、色素含量丰富的木本植物比草本植物就更容易发生褐化。结合近些年研究结果,对木本植物组培中褐化产生的原因、影响因素及克服措施等进行探讨与分析,以供同行参考。1褐化的原因据研究,外植体的褐化分为酶促褐化和非酶促褐化,且以酶促褐化为主。1.1细胞死亡或细胞自然死亡非酶促褐化不涉及酚类物质的产生,主要是由于不利环境条件而导致细胞死亡(称为程序化死亡)或细胞的自然死亡(称为坏死),其中,温度是主要诱因。因此,只要采取适当措施或者外植体适应了胁迫环境就可控制非酶促褐化的发生。1.2褐化的发生条件酶促褐化就是组织内或伤口处分泌的酚类化合物在多酚氧化酶等作用下发生的氧化反应,从而形成了褐色的醌类物质。醌类化合物在酪氨酸酶的作用下,与培养材料组织中的蛋白质发生聚合,引起其他酶系统失活,导致代谢紊乱,生长受阻。故褐化的发生须同时具备酶、底物和氧三个条件。引起褐化的酶主要有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PLA)等。底物主要是酚类化合物,目前鉴定出结构的酚类化合物已达数千种,按其骨架分为苯基羧酸类、苯丙烷衍生物类、黄烷衍生物类3类。在正常发育的植物组织细胞内,多酚类物质与多酚氧化酶是相互分隔、互不接触,故不发生褐化。当在进行切割外植体等操作时,由于破坏了细胞膜的结构,促使多酚类物质与多酚氧化酶相互接触,在氧的作用下,发生氧化反应,形成醌类物质,从而发生褐化现象。2影响棕榈树形成的因素2.1植物外植体及组织的变化外植体基因型:植物的基因型影响褐化发生的频率和程度,不同物种之间褐化程度差异很大,就是同种植物的不同品种间也存在一定差异,因为不同基因诱导植物体内合成的物质有差异。在玉米幼胚组织培养中,沈农糯玉米和白糯1号的诱导褐化率和继代褐化率较低,在10%以下,而沈农266、沈农黄玉米、东糯2号褐化率则都在10%以上,最高达33.3%。外植体年龄:外植体年龄越老,木质化程度越高,褐化就越严重。一般幼龄材料褐化轻,茎尖、叶片等高度分化的组织与成龄材料容易褐化。外植体取材时间:外植体的褐化与取材时间(物候期)有密切关系。因为多酚氧化酶的活性与温度相关。夏季高温,外植体代谢活动强,多酚氧化酶的活性较高,褐化率也高;冬春季则相反,褐化率较低。因此,梨、柿、紫枝玫瑰、阿月浑子、自由人槭等木本植物的取材以温度较低的冬春季为好,褐化率低。外植体大小:切口的大小决定酚类物质的被氧化面的大小,影响褐化的程度。一般外植体越小,褐化也越厉害。在进行枇杷、苹果茎尖培养时,适宜的外植体大小有利于降低褐化。红豆杉愈伤组织的继代以0.7~0.8cm3较适宜,过大或过小都易发生褐化。外植体部位和种类:不同部位的外植体褐化率不同。华盖木以树冠上部枝条顶芽褐化严重,树冠中部枝条顶芽的褐化明显减轻,而树冠下部枝条顶芽褐化最轻。在同一枝条上,一般顶芽(茎尖)比其他部位芽褐化要轻。但阿月浑子、软枣猕猴桃枝条上部芽褐化较重,一定位置的芽褐化反而较轻。此外,外植体部分组织的去除也影响褐化。去除珠被的枣幼胚胚珠褐化率显著低于完整胚。番荔枝去皮幼嫩茎段褐化最轻。这可能与去除部分组织内分泌的褐化物质多、易褐化有关。外植体的水培:水培处理及处理时间与植物外植体的褐化也有关系。生长季节取材,随水培时间的延长,外植体的褐化率呈下降的趋势。外植体的消毒:不同的消毒剂种类对褐化的影响不一样。用升汞消毒的褐化率显著低于氯酸钠处理的,可能与消毒处理时间长短有关,因为消毒处理时间越长,外植体就越容易褐化。外植体的转移时间:外植体的转移时间与褐化也有关系。转移时间越短,越容易控制褐化,沾化冬枣10天转接1次,无褐化现象发生,超过20天转接,褐化发生。此外,在黄连木的培养中,外植体平放褐化比斜插、直插的轻。2.2不同光照条件对外植体褐化的影响温度:温度影响植物体内酶的活性,对组织褐化影响较大。一般低温会降低相关酶(如PPO)的活性,减弱代谢速度,从而抑制酚类化合物的合成,减少醌类物质的形成,进而抑制或减轻褐化。低温条件下,“芭蕾”苹果、板栗、阿月浑子等褐化较轻。高温条件下,酶活性不仅会增强,氧化过程也会加速,褐化更加严重。但在实践中,从低温下转入常温后褐化率高于一直在常温下的培养。光照:低光或暗处理能减弱褐化现象的发生。因为光照会提高酶活性,促进多酚类物质的氧化。在光照条件下,生长的植物体内酶活性较高,酚类物质在受光诱酶的参与下合成为醌类物质。光照过强或光照时间超过16小时的外植体更会加快褐化。而在黑暗或弱光条件下生长,植株组织内受光诱导的酶的活性就大大减弱,进而使得酚类化合物的合成减少,醌类也相应减少,从而使褐化得到减轻。黑暗处理后,桑树、阿月浑子、番荔枝、黑莓等的褐化明显降低。因此,接种前进行一定时间的暗处理对外植体褐化有一定的抑制作用。但长期缺乏光照容易导致培养物叶绿素含量不足,生长不良。光质不同,褐化的程度也不同。黄连木无菌苗在红光和白光下可正常生长,褐化率较低,但在蓝光下,褐化率高且芽体伸长不明显。光照强度与外植体褐化也有一定的关系。黑莓以1500lx光强下外植体的褐化率最低且腋芽诱导率和生长状况均较好。霍霍巴光强低于1000lx时则褐化加重。此外,CO2也影响外植体褐化的发生。高CO2会促进褐化。因为,CO2浓度过高引发细胞内积累过多的CO32-,并与细胞膜上Ca2+结合而使有效Ca2+减少,导致内膜系统紊乱和瓦解,致使褐化发生。但培养室内湿度对褐化没有影响。2.3外植体的褐化在离体培养条件下,不同植物对培养基的要求不同,即使同一种植物在不同的培养基上其表现也不同。培养基成分:无机盐浓度过高也会引起褐化,甚至加重褐化的程度。特别是在初代培养时,培养基中无机盐浓度过高会引起酚类物质外溢,加剧褐化。而较低浓度的无机盐含量,有利于防止植物材料褐化。培养基中Fe、Mn2+和Cu2+等可作为氧化酶类的组成成分或辅因子离子的浓度降低,酶活性也随着降低、从而抑制酚类氧化、减轻褐化。核桃、樱花、桑树、苹果、番荔枝等木本植物以大量元素减半的1/2MS或1/2DKW培养基抑制褐化的效果好。但黑莓、红豆杉、银杏等则以高盐的MS为好。可见,无机盐浓度对外植体褐化的影响因植物种类而异。培养基状态:培养基状态对褐化有一定的影响。从防止褐化的效果来说,纸桥培养基>液体培养基>半固体培养基>固体培养基。因为液体培养中细胞溢出的有毒物质可以快速扩散,而纸桥培养除了这一作用外,滤纸条还有吸附有毒物质的作用,所以褐化最轻,相对而言对外植体伤害较轻。培养基硬度:培养基硬度影响酚类物质的扩散速度。在一定范围内,随琼脂用量加大,培养基硬度变大,褐化率降低。因此,在允许的条件下,适当增加琼脂用量,增加培养基的硬度,从而降低褐化程度。激素:生长调节物质种类和浓度也会影响外植体的褐化。细胞分裂素BA(BAP,6-苄氨基腺嘌吟)、KT(激动素)等具有提高PPO活性、促进酚类化合物的合成的作用,随BA浓度的提高,褐化加重,褐化率提高。而生长素类如2,4-D可延缓多酚合成,减轻褐化发生。此外,不同浓度植物生长调节剂的适宜组合也能不同程度地减轻或抑制褐化。戴维逊棉在MS培养基上加适量的BA、ZT或NAA培养能取得再生植株,而在MS+2,4-D+ZT+NAA上培养14天则全部褐化死亡。pH值:低pH值可降低多酚氧化酶的活性和底物利用率,抑制褐化。高pH值则明显加重褐化。一般来说,pH值4.5~5.0的酸性环境不利于褐化过程的发生。糖:糖也影响褐化发生的程度。果糖、葡萄糖能有效减轻褐化,麦芽糖次之,蔗糖较差,含杂质较多的市售白糖褐化最重。但糖的浓度应适宜,过高或过低均会加重褐化。其他:培养基中的附加成分也对褐化产生影响。水解酪白、谷胺酰胺、高浓度的氨态氮、丝氨酸及硼都会加重褐化的发生。配置培养基的水的硬度与植物外植体的褐化也有一定的关系。硬度低,褐化率也低。而硬度较高的自来水,褐化严重,甚至会出现褐化死亡。可能是配制培养基的水改变了培养基中的无机盐的浓度,从而间接地影响了外植体的褐化。3外植体褐化的防治酶促褐化是外植体发生褐化的主要类型。酶促褐化的发生需要底物、酶及氧气三者同时存在,故在理论上可以通过除去引起氧化的物质———氧、捕捉或减少聚合反应的中间物、抑制有关的酶活性这三点来防止外植体褐化的发生。但外植体的褐化往往受到多种因素的相互影响,防止褐化发生的方法又多种多样,不同的方法又有一定的适用范围和局限性,在解决褐化的发生时应有选择性地采取相应的措施来达到抑制或减轻褐化的发生。3.1外植体的改良不同种类品种、不同时期、不同年龄的外植体,其褐化程度不同,故选择适当的外植体十分重要。一般成年植株较实生幼苗褐化严重,夏季材料比冬季及早春和秋季的材料褐化程度强,木质化新梢比半木质化新梢严重。在采集时以处于旺盛时期,具有较强分裂能力的外植体为植物组织培养之首选。3.2外植体表面酚类物质的提取对较易褐化的外植体材料进行预处理可以减轻酚类物质的毒害作用。适当时间的低温处理、用抗氧化剂溶液对外植体进行预处理、在抗氧化剂溶液中切割或剥离外植体、在接种之前用无菌水反复清洗外植体切口处渗出的酚类物质、经常规消毒后用可溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP2g/L)浸泡10~15分钟预处理、进行适时的水培处理等,均可起到减轻褐化危害的作用。或在外植体采集前对母株遮光、母株经温室一般栽培、外植体经5℃低温预处理一段时间。3.4不同防褐剂的防褐效果在培养基中加入防褐剂是组培中常用的一种有效措施。常用防褐剂有:AC(活性炭)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、Vc(抗坏血酸)、CA(柠檬酸)、AgNO3(硝酸银)、ABA(脱落酸)、Na2S2O3(硫代硫酸钠)、Na2S2O5(偏二亚硫酸钠)、DTT(二硫苏糖醇)、LH(水解乳蛋白)、EDTA(乙二胺四乙酸)、PA(植酸)、Cys(半胱氨酸)、氨基酸、蛋白质、肽、巯基化合物、多胺等。但不同防褐剂的防褐效果因植物材料不同而有差异[16,18,63,64,65,66,67]。即使同一抗氧化剂的不同浓度对褐化的影响也不同。4做好防褐化工作褐化是植物组织培养中的三大难题之一,而木本植物本身富含单宁、木质素、色素等物质,褐化较之草本植物严重。由于褐化与外植体种类、生理状态、营养状况、生长部位、培养基成分、添加生长调节剂的种类和浓度、培养条件等多种因素有关,深入了解褐化产生的原因、褐化的影响因子以及克服措施,从根本上防止木本植物褐化的产生,对提高组培效率、降低经济损失是非常必要的。在实践中,也可将几种防褐化措施结合起来,以达到预期的防褐效果。如在采集外植体前预先进行遮光或室内水培处理,接种前用防褐化剂浸泡,并在2~5℃的低温下放置12~24小时,在控制污染的前提下减少消毒时间,在含抗氧化剂溶液中进行切割,然后接种于含有防褐剂的液体培养基中,在短时间内通过连续多次的转移等来达到抑制或防止褐化的发生。褐化与外植体的基因型、外植体年龄、取材时间、大小、部位、种类等有密切关系。3.3培养基