植物组织培养污染的控制与控制措施

植物组织培养污染的控制与控制措施

植物组织培训技术是20世纪初发展起来的一项新兴技术，在科学研究和生产应用中发挥着越来越重要的作用。但由微生物所引起的污染问题一直是制约当前植物组织培养技术发展的主要障碍,对植物种苗的规模化生产、植物试管基因库的构建、生产成本和宝贵材料保全等方面都产生了负面影响。如何解决这个问题已经引起这一领域科研人员的重视,研究微生物污染的种类、来源和消毒方法以及一些抑制剂种类和用量的筛选,对避免和减轻污染、提高培养成功率和培养物的成活率、降低成本、提高经济效益等都有重要意义。本文针对在植物组织培养中污染产生的原因及控防措施等相关问题的研究进展作出简要综述,并结合实践经验提出一些见解,以期为从事植物组织培养研究与应用的相关人员提供一些技术借鉴和参考。1污染的概念和造成污染的主要原因1.1培养体系污染植物组培污染是指植物组织材料在组培过程中因培养条件下的温度、湿度、pH值和营养条件等适合微生物的生长,从而导致在各培养环节中发生的培养体系污染。这些污染一般出现在材料表面、材料附近的培养基以及培养基的其他部位,表现为霉变、混浊或云雾状、粘液状、发酵泡沫状等不同形状、颜色和大小的污染痕迹。1.2外植体的污染组织培养过程中的污染是研究者感到最棘手的问题,也是影响植物组织培养中种苗成败的关键因素。一般来说,在植物组织培养过程中,细菌污染率高于霉菌污染率,占总污染率80%以上。大多数人认为在组培中较常见的细菌性潜在污染可能是由器具消毒不彻底,带有半致死性细菌引起。而细菌污染中的内生细菌污染情况却更为复杂,所以选择适宜的外植体材料至关重要。屈云慧等研究认为造成污染的主要污染源有真菌、植物病原细菌、病毒和类病毒以及螨或蓟马。真菌来源于空气,可以产生孢子,落于适当的环境中便会迅速增殖形成菌落,污染整个培养容器。植物病原细菌常分布在外植体表面或内部,病毒和类病毒则常存在于植物内部,并利用机械或载体传播。螨是一类寄生在植物或动物体上刺吸液汁或血液的节肢动物,体形微小,蓟马是一种靠植物汁液维生的昆虫。螨或蓟马来源于培养间墙壁、角落,具有活动能力,喜欢吃菌丝,如果不注意培养室的卫生,则培养容器内部很容易受到感染。Leifert等认为植物的组织培养中细菌引起的污染是最严重的,而外植体却常常被多种杂菌同时侵染。1.2.1牧草细菌污染的主要来源材料带菌是污染中重要而又难以避免的污染途径,这一方面与外植体的种类、大小、生长环境、取材部位、取样时间有关;另一方面也与外植体的灭菌方法有关。通过研究发现,通常从一种外植体中可分离到的杂菌有数种至数十种,这种内生菌多样性现象在热带植物中尤为突出,甚至可达数百种。Leifert等认为细菌污染的主要来源有三个:(1)材料内部灭菌处理不彻底,这样造成的污染占污染总数的1/3~1/2;(2)在正常的灭菌条件下,内生菌有时也能存活,这样的污染占污染源的1/4;(3)来自寄主植物的污染占1/4~1/2。Blake等认为牧草虫和螨的体表带有霉菌的孢子和细菌,在九、十月份是重要的污染源,会造成材料带菌,发生组培污染。Reustle等也认为8月和9月牧草虫的大量繁殖造成了组培污染的严重发生。Enjalric等在对三叶胶初级培养污染的研究中发现高温多雨的环境更有利于污染的发生,而且随着植物材料年龄的增长,植物材料的健康状况不断恶化,组培污染也会更加严重。尚宏芹认为内源菌污染是由于外植体材料内部的微生物所引起,不能被一般的表面消毒方法所清除,而是随着材料带入培养过程造成危害。1.2.2接种时培养过程中污染除了外植体带菌,操作过程和培养环境也是引起污染的主要原因,主要表现为:(1)无菌室灭菌不彻底或超净工作台滤出的空气中带菌超标;(2)培养基灭菌不彻底;(3)交叉污染;(4)工作人员操作不当导致的污染。无菌室灭菌不彻底就会产生寄生虫和其他带菌生物,而昆虫媒介会将环境中的真菌孢子转移到材料中,进一步导致材料污染。培养基灭菌不彻底而发生的污染主要由细菌和真菌引起。细菌污染表现为:培养基表面出现黏液状物质、菌落或呈浑浊的水渍状甚至泡沫发酵状,这其中以芽孢杆菌引发的污染最为普遍和严重,呈现乳白色,或以滴形云雾状存在于培养基内。这种菌外被夹膜,能耐一定的高温、高压,对紫外线有一定的抗性。真菌污染表现为:培养容器内往往会出现白、黑或绿等不同颜色菌丝块,以曲霉、毛霉和青霉属真菌最为常见,此时,如果菌落只存在于培养基表面,则也有可能是由于培养容器的瓶塞、瓶口包扎松弛,使培养室空间中弥散的真菌孢子进入容器内引发污染。交叉污染是指接种用具灭菌不彻底,接种时由于材料自身带菌,部分未污染材料与污染材料一起接种或一起培养从而导致未污染材料污染;或者是未及时发现污染苗,使真菌孢子随空气污染到其他培养基等。由于无菌操作不当而导致的污染更不可忽视。首先,进行无菌操作的工作人员本身即是最大的带菌者,其衣服、毛发、手等都隐藏着大量的微生物;其次,工作人员使用了未经充分消毒的工具(镊子、剪刀、烧杯、培养皿等);同时在进行操作时由于呼吸时排出的大量细菌以及因手碰到器皿边缘或不慎接触材料,都会导致增加污染的机会。2外植体带菌污染防治对策真菌性污染可通过严格的消毒措施及改善培养环境等来克服,而对于细菌性污染除要求操作人员严格按照无菌操作规程操作外,对外植体带菌引起的污染,还应结合预防内源性污染的对策,从而把污染率降低到可以接受的范围,来提高组培苗的质量和产量。2.1用于污染防治的材料2.1.1材料污染率高材料带菌是指原始材料本身带菌,或者继代培养的材料本身带有病菌。通常多年生材料上细菌数较幼嫩材料多;田间材料上细菌数较温室内材料多;温室材料上细菌数较水培材料多;带泥土的材料上细菌数较不带泥土的材料多;未经过阳光照射过的材料上细菌数较经过阳光照射过的材料多。一般来说,具有块根块茎和鳞茎类的植物由于长期生长在存有大量微生物的土壤环境中,本身带有很多细菌,故应避免将这类材料作为外植体。体积大的材料相对于小材料有较大的表面积,带菌相对较多,因而污染率较高。孟杨等在湖北百合组织培养技术研究中发现,接种时分割的鳞片大小不同,污染率也有所不同,如0.5cm×0.5cm的鳞片,污染率为5%;0.8cm×0.8cm的鳞片,污染率达到8.3%。取材的时间,应多在晴天中午进行。因枝条暴露在强烈阳光下,有利于杀菌。外植体在取材前一般可用杀虫剂对其进行喷洒,以防止由于寄生虫带菌而带来污染。枝条类外植体取材部位以材料中上部的茎段较为有利,也可以采用新生的或新抽的材料如水培抽出的芽条、新萌发的萌蘖条、5~6月间的新生叶、枝条、茎尖、叶柄等材料,污染率可下降到20%~30%。也有研究表明用胚作外植体极易培养成功,因胚不易污染且具有极幼嫩的分生组织细胞。2.1.2外植体的保鲜利用目前,外植体表面灭菌中经常使用的消毒剂有氯化汞、乙醇、次氯酸钠以及卫生间消毒液等。有研究人员在实践中尝试使用了一些新的灭菌方法。如,使用真空减压灭菌、磁力搅拌、超声波振动、多次消毒(灭菌)、混合消毒液等方法进行灭菌。周俊辉等对玛丽安万年青采用减压灭菌,利用减压抽走植物组织中的气体使消毒剂更易进入植物内部,从而增强杀菌效果,使污染率从对照的93.3%降低到40.0%。郭海滨等将卷丹百合鳞片先以70%乙醇浸泡10s,再用0.1%氯化汞消毒12min,污染率达到65%,而用乙醇浸泡30s,再用氯化汞浸泡15min,污染率可降到15%。许婉芳等将杀菌剂加入金线莲培养基中,发现50%多菌灵的效果优于70%甲基托布津和25%甲霜灵,其抑菌率达100%且能促进金线莲的生长。木本植物当年生茎段材料作外植体时,应先将采集的材料用自来水冲洗2~3h,若外植体生长环境较脏,可以进行水培或者液体培养,选择新抽生的嫩枝或者嫩芽作为外植体。用茎尖作外植体材料时,可在人工气候箱或无菌条件下将种子进行暗培养或黄化培养,以减少外植体所带的细菌。有些外植体材料表面具有绒毛,在消毒液中滴加几滴吐温-80,会使消毒液与材料充分接触。在操作中如果发现外植体所带细菌较多,则可以进行间隔多次消毒或使用多种消毒剂。通过促发新枝,热击,用杀菌剂或抗生素进行预培养对母株预处理,改善植株栽培环境等均可降低外植体的污染率。李群等用48℃的水浴及低温处理不同的材料都得到了较好效果,污染率控制到了较低水平,且对材料没有副作用。周俊辉等用不同抗菌素对外植体进行预培养,以抑菌剂ANB1和ANB2的抑菌效果较好,其中ANB2处理后的未污染率达到76.7%。Levin等用300mg/L利福平有效控制了合果芋丛生芽继代培养中出现的污染菌。多种药剂交替浸泡法是对一些容易污染而又难灭菌材料常用的灭菌方法,李颖、李春燕用多菌灵和青霉素混合液浸泡污染苗能有效杀灭真菌;用组培污染苗作外植体,用自来水冲洗0.5h,再在超净工作台上用乙醇和氯化汞进行短时间的处理,试验结果表明,该方法消毒效果较好,再度污染率几乎为零。2.2环境处理和人类疾病2.2.1培养环境的管理目前,通常避免在高温高湿的天气接种,并注意无菌室的除湿和熏蒸消毒。由于无菌操作室相对较密封,还应做好培养环境的管理。一般半个月左右开窗换气,每个月用高锰酸钾或甲酚皂溶液进行室内彻底消毒,定期(如一个月)开启臭氧发生器对培养室灭菌消毒,以免造成细菌周期性大面积发生。及时清除污染材料,转移继代材料。污染的材料及瓶子要用药液消毒并处理干净,必要时须经过高温高压灭菌后方可使用。定期检查超净工作台污染情况。2.2.2材料的消毒和更换一般对培养器皿和接种工具进行高压蒸汽灭菌法或烘箱干热灭菌法灭菌。高压蒸汽灭菌出锅后的接种纸最好放入烘箱烘干水分后2d内用完,刀、剪、镊子等金属用具,在每次操作(接种)开始前在75%乙醇中浸泡5~10min,再在酒精灯的火焰上灼烧消毒或在带有石英砂的消毒器内高温消毒5~10min,冷却后使用。在接种期间接完一瓶母瓶材料,器具需消毒一次。切割完一瓶母种材料后及时更换无菌纸,以免材料间交叉污染。定期检查无菌纸是否有破损如洞眼、破裂等,对已破损的无菌纸及时更换。还要注意接种工具、材料避免与酒精灯、超净工作台铁网面、台面接触。2.2.3组培养液常用杀菌方法目前,培养基的消毒一般采用高压蒸汽灭菌法。使用时要保证灭菌锅内部清洁,内部的冷气排尽,装填的灭菌物不能堆放过满,保持灭菌锅温度在121℃左右20min,降温过程不能操之过急。灭菌后进行抽样培养,确保培养基表面无污染现象,以避免培养基污染造成的损失。有研究通过对比一次和二次排空气法对培养基的灭菌效果发现,经过两次排气灭菌,没有发生培养基灭菌不彻底现象,而使用一次排气法进行灭菌时,有时会发生因无法排净灭菌锅内空气而使培养基灭菌不彻底。另外,可以利用高压灭菌和干热灭菌相结合的方法提高灭菌效率。对于专用组培塑料瓶,可以用化学杀菌方法来弥补充无法干热灭菌的缺陷。在培养基中加入其他抑菌剂也是一种常用的降低污染的方法。由于植物材料的内生菌潜伏较深,表面消毒方法无法将其彻底消除,初次培养可能无污染现象出现,但随着继代次数的增加,菌量逐渐累积,污染现象也会随之出现。黄小荣等认为植物组织培养中细菌污染的原因是休眠细菌芽孢萌发的结果,在香水白掌的组织培养中,通过连续添加青霉素,可抑制细菌污染,使培养体生长健壮。在培养基中加入两种或两种以上的抗生素,可以更加有效的防止细菌产生抗药性,其效果比单独使用效果更佳。周俊辉等在万年青茎段培养中,在培养基中加入50mg/L利福平和50mg/L氯霉素,使其污染率从原来的81.55%降低到15.62%,有效防止了外植体的污染。另外,使用单宁酸也可以达到抑制污染的效果。在使用抗生素时要明确抑制病菌的种类,使用的抗生素是否对培养的植物组织有不良影响以及抗生素的使用浓度和处理时间。高浓度的抗菌素会伤害植物材料,引起对生长的抑制或畸变。而且抗生素通常只能抑制细菌生长而不能完全杀灭细菌。需要引起重视的是,抗生素有可能会引起微生物产生抗性突变体,使潜伏的污染对植物以后的生长造成影响。2.2.4接种过程的消毒处理为最大限度降低人为污染,工作人员进入接种室前要更换干净的白大褂和拖鞋,衣服、鞋每次穿用过后应该经紫外灯照射消毒,并定期清洗;接种人员接种前用肥皂清洗双手,再用乙醇仔细擦拭一遍,及时剪指甲,双手不能接触材料或器皿边缘,接种过程应该轻开盖、快操作。在工作时注意避免交叉污染,工具用1次消毒1次,要保证所用的接种工具经过彻底的消毒再去切割其他的健康材料。尤其是滤板和紫外灯都有标定的使用年限,应按期更换;经常检查培养容器及封口材料,玻璃培养容器清洗时已发生碰撞,缺口或裂缝的应淘汰不用,封口材料多用塑料盖、胶塞、棉塞、塑料薄膜等,使用过久会发生老化或者划破,导致密封性差,造成污染,须及时更换。工作人员呼吸所产生的污染,主要是在接种时说话或咳嗽所引起,因此操作时严禁随意交谈,并应戴口罩。此外,还要做到反复检查培养物。因为有的污染很长时间后才会表现,有的污染不经仔细检查不易发现,经反复检查后,对已污染的母瓶材料及时进行处理和淘汰。3组培中细菌和真菌的应用植物组织培养中出现的各种污染问题,是制约植物种苗培育的重要因素,也是当今组培领域的一大难题,是研究者们一直在努力探索解决的课题。在外植体灭菌中,除了采用常规的化学方法外,还研究应用了新的技术方法,如利用真空减压灭菌、磁力搅拌、超声波振动、混合消毒液等方法进行灭菌,并取得了较为显著的效果;采用二次排气法提高高压灭菌效果;在培养基中加入两种或两种以上的抗生素,防止细菌产生抗药性。但是,还有很多方面的问题亟待科研工作者们的解决,如,外植体内源菌灭菌不彻底,继代培养过程中易受到污染等。抗生素一般不稳定,