紫杉醇及紫杉烷的研究进展

紫杉醇及紫杉烷的研究进展

0杉烷醇的应用紫杉醇是一种重要的抗高血压药物。紫杉醇是紫色醇代谢前和支代谢产物。一些紫杉醇具有特殊的生理活性。紫杉醇及紫杉烷的产量低一直是制约其应用的主要瓶颈,如何扩大药源是一直以来面临的难题。已经开发出一些生产紫杉醇及紫杉烷的技术,其中植物细胞工程方法因为不占用耕地,环境友好,可调控,符合可持续发展战略而受到普遍的重视。1紫杉醇和紫杉烷1.1“紫杉醇”致刑事诉讼1963年,Wall发现短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)树皮提取物具有抗肿瘤活性。1967年,Wall和Wani分离出紫杉醇(paclitaxel),1971年,通过X射线衍射和核磁技术解析了紫杉醇的结构。1979年,Horwitz揭示了紫杉醇抗肿瘤的机制:它可以稳定微管的聚集并防止微管正常的生理解聚,对于增殖速度极快的肿瘤细胞,它可“冻结”有丝分裂的纺锤体,从而使肿瘤细胞分裂停止在G2和M,直到死亡。紫杉醇是发现的第一个促进微管聚合的药物。1984年和1985年分别进行了紫杉醇的一期和二期临床试验。在1989年和1991年,分别发现了紫杉醇抑制卵巢癌和乳腺癌的显著活性。美国食品药品管理局(FDI)在1992年和1994年批准紫杉醇为治疗卵巢癌和乳腺癌的临床药物。1993年,百时美施贵宝公司(Bristol-MyersSquibbCompany)以Taxol®为商标将紫杉醇投入市场。2000年,销售额已达16亿美元。现在,紫杉醇和其半合成衍生物多烯紫杉醇docetaxel(紫杉替尔,Taxotere)已经成为临床治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌的一线药物。此外,紫杉醇及多烯紫杉醇还用于治疗肺癌、卡波西肉瘤、结肠癌、黑素瘤以及淋巴瘤。紫杉醇作为红豆杉科红豆杉属植物的主要次生代谢产物,主要存在于树皮及针叶中。化学结构分为2个部分(图1):基本骨架为一个紫杉烷(taxane)类的三环二萜,侧链包括3个芳香环(1个苯环,2个苯甲酰环)和1个环氧丙烷环(D环),合起来有7个环,其核心为四环二萜。其分子式为C14H51NO14,分子量为853.92。1.2紫杉烷的骨架紫杉醇抗癌活性的发现激励人们去分离更多其他紫杉烷类化合物,以期找到具有更好活性的化合物。第1个紫杉碱由Lucas在1856年发现,到1999年已鉴定结构的紫杉烷二萜化合物超过350种。绝大多数紫杉烷化合物含有苯甲基三环十五烷骨架,即紫杉烷骨架。近年来发现的其他骨架均是这一基本骨架的重排,已经发现很多紫杉烷具有特殊的生理活性,比如最初从云南红豆杉(Taxusyunnanensis)的根中提取得到的云南紫杉烷C-Tc(TaxuyunnanineC)是一种具有类神经生长因子(NGF)活性的化合物,能够强化NGF的作用,有利于老年痴呆症(Alzheimer’sdisease)的治疗。2紫杉醇的生产紫杉醇最初从短叶红豆杉树皮中提取,含量仅有万分之几,1kg紫杉醇需要2000~3000棵短叶红豆杉的树皮或10余吨枝叶。紫杉醇供给问题引起了广泛关注,资源不足成为制约紫杉醇临床应用的主要因素。尽管Holton和Nicolaou研究小组在1994年分别独立全合成了紫杉醇,之后又有许多不同途径成功合成了紫杉醇,但都因步骤繁琐,产率低而无法工业化。美国国立癌症研究所(NCI)授权百时美施贵宝公司解决药源问题,开发的药源有:由红豆杉可再生的枝叶中提取;由提取的紫杉烯半合成紫杉醇;由植物组织培养获得。一个重大突破是Potier发现浆果红豆杉(Taxusbaccata)针叶中含有10-去乙酰基巴卡亭III(10-deacetylbaccatinIII,10-DAB)和巴卡亭III(baccatinIII)。Holton的研究团队由10-去乙酰基巴卡亭III(在各种红豆杉植物中均含有,由可再生的枝叶中提取)开始,经过4步反应,合成紫杉醇,由此向临床供给了大量紫杉醇。紫杉醇的销售额由1994年的4亿美元增长为2000年的16亿美元。目前市售的紫杉醇按原料来源不同分为2类:一类是直接从红豆杉植物中提取;另一类为半合成紫杉醇,即从红豆杉嫩枝条或树叶等可再生资源中提取10-去乙酰巴卡亭III,或用提取紫杉醇过程中的副产物如7-木糖、10-去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱等为原料经化学半合成生产紫杉醇或多烯紫杉醇。但半合成方法有环境污染问题,由原植物中提取加工通常以理化方法为主,该方法破坏资源、不利于环境的可持续发展。虽然1993年Stierle等报道在真菌Taxomycesandreanae中发现紫杉醇,为紫杉醇的供给开辟了新的途径,但紫杉醇在真菌中产量太低(25~50ng/L),需要改良菌种大幅度提高产量才有商业化的可能。相比之下,利用植物细胞和组织培养技术进行紫杉醇及紫杉烷的生产具有无可比拟的优势:(1)不占用耕地,生长周期短,不受地区、季节和气候的限制,便于开展大规模的生产;(2)无污染,无重金属积累,产物疏松,利于有效成分的生产和积累;(3)细胞生长过程可控制,代谢过程可调节,有利于提高目的产物的产量,并且避免了利用天然植株产生的无用部位的浪费;(4)利用高产细胞株的筛选和复壮技术,可以使目的产物产率几倍甚至几十倍地提高;(5)对培养物诱导或因其自发突变,可以产生一些原植株所没有的次生代谢物质;(6)可用生物转化的方法将一些较初级的化合物转化成医药上更为有效、高值的药物。采用植物细胞培养技术生产紫杉醇具有很大潜力。PhytonInc和ESCAGenetics公司报道,紫杉细胞培养到第40天时紫杉醇含量达0.3mg/g干重。在1998年百时美施贵宝公司与PhytonInc公司签署协议采用发酵技术使紫杉细胞培养技术产业化。2004年,利用植物细胞培养技术生产紫杉醇获得美国总统“绿色化学奖”。研究发现,经不同诱导方式获得的细胞株其表达的目标产物存在显著差异。红豆杉细胞培养过程经常会产生紫杉烷类化合物,如,中国红豆杉细胞培养体系中发现含量较高的Tc。自从在中国红豆杉悬浮细胞培养体系中发现含量较高的Tc以来,钟建江教授及其同事使用各种调控技术提高Tc的产量,使Tc产量在1L气升式反应器中达到612mg/L。后来他与合作者使用新合成的诱导子,使得摇瓶中Tc的最高产量在培养第21天达到856mg/L,反应器中Tc的最高产量在培养第21天也达779mg/L。Choi等在中国红豆杉细胞培养第35天获得Tc的最高产量为885.9mg/L。3愈伤组织的诱导利用植物细胞培养生产次生代谢产物,首先要筛选含有目标次生代谢物的植物及最好的基因型,选择合适的部位做外植体进行愈伤组织诱导。愈伤诱导过程中筛选合适的生长培养基,进行传代培养,经过多代培养,得到稳定生产的细胞系。从多个细胞系中筛选生长和生产状况最好的稳定的细胞系,对之进行生物合成途径、诱导、固定化及基因修饰等方面的研究,最终在反应器中进行发大生产,进行过程工程调控。4增加细胞生物量提高细胞中紫杉醇及紫杉烷的产量包括2个方面:一要提高细胞的生物量,二要增加目的产物的表达。要有效提高紫杉醇及紫杉烷的产量,需要综合考虑以下多方面的因素,有时需将多种方案综合使用才能达到理想的效果。4.1组织合成紫杉醇及紫杉烷的能力不同外植体诱导愈伤组织的能力和诱导的愈伤组织合成紫杉醇及紫杉烷的能力均不同。选择外植体时应考虑到外植体部位、取材季节、器官生理状态和发育年龄以及外植体的大小等。4.2筛选高产细胞株解决植物细胞培养生产次生代谢物产量低的有效的手段之一是筛选高产细胞株。常用的方法有目视法、放射免疫法(RIA)、酶联免疫法(ELISA)、流式细胞测定法和生物法等。4.3养基组成及培养基选择培养条件包括培养基组成和pH、温度、光照、通气、接种量等的优化,其中培养基组成又包括基础培养基的选择以及激素的种类和浓度配比等。在红豆杉细胞培养过程中向培养基中流加蔗糖溶液,既可以避免前期蔗糖浓度过高的不利影响,又可以在培养后期提供充足的碳源,调节渗透压,利于细胞的生长和紫杉醇(烷)的生产。4.4固定化培养过程4.4.1固定化细胞培养植物细胞有细胞壁和大的液泡,对剪切力十分敏感,易受机械损伤。固定化细胞培养技术是在可控条件下使植物悬浮培养的细胞聚集成团并且限制在特定空间和表面上,使这些细胞团在不损失生物量的同时能连续不断地分泌次生代谢物质。固定化的方法主要有吸附在载体上,包埋在多孔凝胶珠或微胶囊中。目前这一技术应用中遇到的难题是次生代谢产物释放的问题,因为大部分次生代谢产物都储存在液泡内,对其自身的积累起着负反馈作用,使固定化培养不能连续操作。另外,长时间的固定化培养也易使细胞受污染。4.4.2两段培养法生长与生产非偶联型的培养体系,细胞的最适生长条件和最适生产条件是不同的。两段培养法就是根据这点,把培养过程分为细胞生长期和次生代谢物生产期2个阶段。在不同阶段分别采取不同的培养条件,在细胞生长期使接种细胞大量繁殖,提高比生长速率,尽快获得高密度细胞;在生产期则可保持细胞的高密度,维持存活率,降低细胞死亡速率,持续获得目标产物。4.4.3两相培养法植物细胞两相培养是在细胞外创造一个储藏次生代谢产物的单元(如固体吸附剂),从而打破原有产物在细胞内、外水相的平衡,使目的产物产量大幅度提高。采用两相培养技术可以减少次生代谢产物的反馈抑制作用,保护次生代谢产物免受酶的分解,简化下游处理过程,除去培养基中的有害物质。固液两相培养中使用的固体吸附剂有:AmberlteXAD-2,XAD-4,XAD-7,XAD-8,XAD-16等。可用于生产各种次生代谢产物,包括紫杉醇。固体吸附剂的加入方式有以下3种:(1)直接添加到培养体系中;(2)包裹后加入到培养体系中;(3)不添加到培养体系中,而是加到柱子中进行培养基的循环,吸附培养基中的代谢产物。固体吸附剂通常是在培养细胞的指数生长初期加入,与其他调控手段联合使用提高培养细胞次生代谢物的产量。4.5紫杉醇合成前体物物价值的合成前体指处于目标代谢物代谢途径中上游的物质,加入前体可以消除关键酶的阻碍或阻断内源性中间体的分隔和有效贮存,利于次生代谢物的生产。草酸钠是紫杉醇C-10位乙酰基的前体物,加入后虽然可提高紫杉醇产量,但幅度有限;柠檬酸是紫杉醇三环二萜合成的前体物,加入后对紫杉醇合成的影响相对明显;α-苯丙氨酸和β-苯丙氨酸均是紫杉醇C-13侧链的前体物,若添加浓度合适,会对紫杉醇合成产生较大影响。研究发现,单种前体的加入对紫杉醇产量的影响不大,不同前体配伍可明显提高紫杉醇产量。4.6紫杉醇的诱导诱导子指能与细胞发生相互作用,通过胞内一系列信号转导过程,作用于细胞次生代谢相关的基因表达,进而改变细胞次生代谢相关酶的活力,最终使细胞次生代谢水平发生改变的物质。诱导子对植物细胞培养生产次生代谢产物的影响与诱导子的浓度、诱导子作用的时间等因素有关。不同诱导子的加入可导致紫杉烷类不同谱分布,即具有不同的诱导选择性。4.6.1水杨酸水杨酸(salicylicacid,SA)作为一种新的植物激素,在植物抗病反应中发挥了重要的信号分子作用。紫杉醇作为红豆杉属植物产生的一种植保素,它的产生与细胞的抗性反应有着紧密的联系。因此SA也可诱导紫杉醇的产生,这方面有一些报道,但新的深入研究仍较少。4.6.2硝酸银韩国Samyang公司研究者发现浓度为10μmol/L硝酸银加入培养基1周后,紫杉醇产量开始明显上升,最高产量达98.95mg/L,为对照组的4.7倍。茉莉酮酸类诱导子在紫杉醇诱导中应用普遍。甲基茉莉酮酸在诱导紫杉醇产量提高的同时,巴卡亭III、10-DAB产量下降,三尖杉宁碱在对照组和诱导组产量均非常低,没有明显变化。4.6.4花生四烯酸Srinivasan发现花生四烯酸诱导下中国红豆杉愈伤组织中紫杉醇产量提高了9.3倍。花生四烯酸浓度为0.1mg/L时,紫杉醇产量最高。4.6.5柠檬酸铵Samyang公司的研究人员发现柠檬酸铵对紫杉醇产量的促进作用比硝酸银更快,其对紫杉醇生产的促进作用在添加1周内即体现出来,在加入1~2周时间内,对紫杉醇生产的促进作用达最大,紫杉醇最高产量达103.6mg/L,约为对照组的5倍。4.6.6稀土元素对红豆杉细胞紫杉醇生产的影响硝酸铈铵、硝酸镧、硝酸亚铈均能明显提高红豆杉细胞合成紫杉醇的能力,其中硝酸铈铵能力最强,可使细胞中紫杉醇产量提高12倍,发酵液中紫杉醇产量提高5倍。4.7优化代谢途径抑制剂可抑制支路代谢和其他相关次生代谢途径,使代谢过程有利于目的次生代谢物的产生。矮壮素被认为是旁路代谢抑制剂,使代谢向生成紫杉醇的方向进行。5问题和建议5.1紫杉醇及紫杉烷产量调控的过程(1)许多建立起来的红豆杉悬浮培养细胞系不生产紫杉醇,只生产另一代谢支路的14位氧化的紫杉烷。(2)提高紫杉醇及紫杉烷产量的调控策略大多集中于生物合成过程,较少留意后生物合成过程——紫杉醇及紫杉烷合成后的运输、贮藏、分泌、降解等过程。事实上,紫杉醇及紫杉烷最终的产量高低不仅取决于生物合成能力,也取决于生物合成后的贮运分解情况。5.2生物合成产物的修饰及贮藏(1)在酶和分子水平阐明紫杉醇及紫杉烷的生物合成途